单链DNA结合蛋白及聚乙烯亚胺与DNA相互作用的AFM单分子力谱研究

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枯草芽孢杆菌的单链DNA结合蛋白(BsSSB)是一种重要的蛋白质,在基因的复制、修复及转录过程中都起到了极其重要的作用。因此研究该蛋白的结构与功能对于揭示原核生物与真核生物的生命活动的本质至关重要。但是到目前为止,由于缺少晶体结构,人们对与BsSSB的结构与性质的信息还知之甚少。因此,本论文以基于AFM技术的单分子力谱为主,传统的生物学方法为辅,研究了BsSSB与单链DNA之间的相互作用。(1)我们首先利用基因工程的方法构建并纯化了末端同时含有组氨酸标签(N端)与半胱氨酸(N端或C端)以及末端只含有半胱氨酸(C端)的三种突变型BsSSB蛋白。然后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了组氨酸标签与半胱氨酸的引入对BsSSB自身结构及该蛋白与单链DNA相互作用的影响。(2)随后,根据第一部分的研究结果,我们选用了N末端含有组氨酸标签而C末端含有半胱氨酸的突变型BsSSB蛋白进行蛋白质与DNA相互作用的研究。我们利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳研究了BsSSB与单链DNA之间的不同摩尔比对其结合模式的影响,同时还利用基于AFM技术的单分子力谱研究了盐离子浓度对BsSSB与单链DNA之间相互作用力的影响。此外,我们还通过向BsSSB-ssDNA复合体体系内引入互补单链DNA序列的方法来研究复合体上的单链DNA的解离的情况。基因载体一直是基因治疗领域的研究热点。在众多的基因载体中,隶属于阳离子聚合物载体的聚乙烯亚胺(PEI)以其较高的转化效率、相对简易的制备过程以及优廉的制备成本而成为了研究的热点。然而,目前针对PEI与双链DNA相互作用的研究基本都是基于传统的生物学方法,给出的是大量分子的平均效应。要想深入地揭示PEI与双链DNA相互作用的机理,单分子水平的实验信息是必不可少的。因此,我们利用基于AFM技术的单分子力谱研究了聚乙烯亚胺(PEI)与双链DNA之间的相互作用,尝试从单分子水平为基因载体的研发提供直接信息。(1)我们首先将双链DNA固定在基底上,通过向体系内加入不同浓度的PEI溶液来观察双链DNA的力学响应信号的变化。同时,我们还对同一个双链DNA进行往复拉伸,以观察PEI从PEI-DNA复合体上的解离情况。(2)随后,我们将PEI与双链DNA精确地按照一定的氮磷比混合,然后再将PEI-DNA复合体吸附在基底上进行单分子力谱实验,以验证我们第一部分得到的实验结果的准确性。(3)最后,我们还研究了不同的溶液pH值对PEI与双链DNA相互作用的影响。
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