转抗菌肽基因泡桐抗丛枝病的研究

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泡桐丛枝病是素有泡桐癌症之称,制约着我国泡桐产业的发展,目前生产上尚无有效的防治措施。该病病原物为植原体,无细胞壁,仅具3层单位膜,针对此特点,武汉病毒所植病组将广谱抗菌的抗菌肽shiva—1基因转入泡桐,并进行了分子鉴定,确证抗菌肽基因整合到泡桐基因组上。在此基础上,本研究对转基因泡桐进行了以下工作。对转基因病泡桐组培苗进行了外源基因检测,Southern杂交结果表明外源基因已经插入泡桐基因组内,经PCR,扩增出一条250bp左右的带,与抗菌肽基因大小一致;点杂交结果表明以含有植原体的病泡桐为出发材料的转基因泡桐在组培传代过程中,体内仍然含有植原体。筛选出了转基因泡桐的生根培养基:1/2MS+0.5mg/1IBA+6g/l活性炭。该生根培养基生根率可达98%。对转基因泡桐的移栽方法进行了一些改进,移栽成活率可达80%,光照和湿度是影响移栽成活的两个重要因素。选择转基因泡桐3号、6号无性系病苗为材料,在温室内进行抗性鉴定,两个无性系在鉴定期内表现了良好的抗性,在鉴定末期,转抗菌肽基因泡桐的平均病级与对照相比低3级;鉴定后期与鉴定前期相比,转抗菌肽基因泡桐平均病级下降1.5级。其中3号无性系后期无外观症状,6号无性系中6-1仍有外观症状,但症状与前期相比减轻。点杂交结果也证明转抗菌肽基因泡桐体内的植原体含量下降,对照植原体含量高。转基因泡桐的丛枝症状是逐步消失,但在条件适宜的情况下,外观症状可以加重。以人工合成的抗菌肽为抗原,免疫BALB/C小鼠获得了间接ELISA效价为10~4的抗血清。利用改进的间接ELISA对转基因泡桐进行了抗菌肽基因的表达检测,部分无性系的抗菌肽表达量较高,部分无性系表达量低或者没有表达,检测不出抗菌肽的表达。转基因泡桐的抗丛枝病的能力与抗菌肽的表达相关。在温室内,部分转基因泡桐在2000年10月份有花蕾出现,经套袋自交,现已正常结实,而对照未出现此现象;转基因泡桐的株高与对照无显著差别;尚未观察到转基因泡桐有其他的变异生物学性状。以上结果表明抗菌肽基因已经稳定的整合到泡桐基因组内,部分获得表达能够增强泡桐对丛枝病的抗性。这是利用基因工程手段防治植原体的首例,为防治泡桐丛枝病提供了一个新手段,也为其他难培养菌开辟了一条新途径。
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