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绒毡层的发育是一个复杂而精密的细胞行为,而且是在极短时间内接连完成,其中涉及到了大量基因的特异性表达与关闭。已有的研究表明拟南芥转录因子DYT1、TDF1和AMS在调控绒毡层细胞功能分化方面发挥重要的调控作用。为了详细了解这三个转录因子功能上的差异,本文的研究工作在前人的基础上,对dyt1-2突变体,tdf1突变体和ams的等位突变体ams-2突变体花药发育的第6-8期的细胞学变化进行了比较,并利用启动子驱动GUS报告基因的方法研究了DYT1的表达谱,同时获得了一株tdf1的等位突变体npg。主要结果如下:
1、对dyt1-2、tdf1和ams-2突变体花药发育第6-8期横切面药室壁组成的观察发现:三者共同的变化是中层细胞退化过程不完全,绒毡层细胞空泡化,不能特化为分泌型细胞;不同之处是dyt1-2突变体药室壁中层细胞能按时启动退化,tdf1突变体药室壁中层细胞不能启动退化,ams-2突变体药室壁中层细胞提前启动退化。上述结果提示转录因子DYT1、TDF1和AMS在中层细胞退化和绒毡层细胞功能分化中具有不同的功能。
2、对dyt1-2、tdf1和ams-2突变体花药发育第6-8期横切面观察还发现dyt1-2突变体和tdf1突变体的花粉母细胞虽能形成胼胝质壁,但胼胝质在细胞表面的分布不均匀,其四分体小孢子之间的胼胝质含量也减少,并且花粉母细胞和小孢子细胞内容物也较少。ams-2突变体的花粉母细胞形态较饱满,但胼胝质壁较薄。这三个突变体的共同特征是胼胝质不能及时降解,小孢子不能从四分体中释放出来。上述结果表明DYT1和TDF1在花药发育的第6期可能促进花粉母细胞内容物的合成,调控胼胝质的合成以及在细胞壁上的沉积,而在花药发育第7期,参与调控小孢子之间胼胝质的合成,在花药发育的第8期,DYT1、TDF1和AMS可能都参与调控胼胝质的降解过程。
3、为了了解DYT1的表达谱,构建了proDYT1631::GUS载体并获得了转基因植株。对proDYT1631::GUS转基因植株花序GUS染色结果的观察发现GUS活性开始出现于花药发育第6期的雄蕊,并且在花丝基部活性最高;在花药发育第6-8期在花丝和花药组织的各种细胞中都有活性,到花药发育的第9-11期,只在花药的各种组织细胞中具有活性。上述结果提示DYT1蛋白在花药发育的第6期开始出现于整个雄蕊,包括花丝和花药,并且在花丝基部含量最高;在花药发育第7、8期在花丝和花药组织的各种细胞中都有DYT1蛋白,到花药发育的第9-11期,只在花药的药室壁细胞和花粉中存在DYT1蛋白,花丝中已不存在DYT1蛋白。
4、npg突变体是从拟南芥Salk_041443株系中筛选得到的。通过对npg突变体花药发育的细胞学观察,发现该突变体的表型与已经研究清楚的dyt1-2、tdf1和ams-2突变体表型十分相似。等位分析结果表明npg突变体是tdf1的等位突变体。将npg突变体中编码TDF1的序列克隆后测序发现npg突变体中编码TDF1蛋白的基因第三个外显子上发生了两处碱基替换:一个是459bp处TGG-TGA,另一个是988bp处CAT-AAT,造成编码TDF1蛋白的序列提前终止。
本文还根据已公开的基因芯片数据,对拟南芥转录因子DYT1、TDF1和AMS在功能上的差异进行了初步分析,并提出了进一步深入研究的可能途径。