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前言
乳腺癌易感基因(The breast cancer susceptibility gene 1;BRCA1)低表达在散发性卵巢癌中是一个普遍现象,有报道表明BRCA1低表达可增加卵巢癌对化疗药物的敏感性,目前散发性卵巢癌中BRCA1是否能够作为指导临床治疗或预后估计的生物学标志还没有定论。本研究通过检测BRCA1在中国女性散发性卵巢癌组织中的蛋白表达水平及甲基化情况,分析二者之间的相关性,并分析它们与卵巢癌患者临床病例参数及预后的相关性,探讨BRCA1蛋白表达和/或甲基化在临床卵巢癌预后估计及治疗中的可能意义及价值。迷乱性甲基化是肿瘤发生发展中的一个普遍现象,(DNA methyltransferases;DNMTs)是介导DNA甲基化的关键因素,本研究通过免疫组化检测DNMT在卵巢癌中的蛋白表达情况分析三种DNMT的表达情况与BRCA1启动子区甲基化的相关性;DNA甲基转移酶DNMT在多种恶性肿瘤组织过表达且与不良预后有关,DNMT在卵巢癌中的表达情况尚未见报到,通过分析DNMT表达水平与卵巢癌患者临床病例参数及预后的相关性,初步探讨DNMT抑制剂在卵巢癌治疗中的可能性及意义。
材料与方法
一、病例组织标本
收集中国医科大学附属第一及第二院医院妇产科2002年1月-2010年10月间经病理诊断明确的散发性卵腺癌手术切除标本142例及卵巢良性肿瘤组织44例,所有患者均无家族史。临床分期按FIGO(International Federation of Gynecologists and Obstetricians classification system)分期。病理组织学的诊断依据世界卫生组织(World Health organization,WHO)标准进行。所有患者术前均末接受化疗、放疗及其他抗癌治疗。85例患者具备临床随访资料科进行生存及预后相关分析。
二、试剂
兔抗人DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、抗体均购为美国SantaCruz公司产品,鼠源性单克隆抗人BRCA1抗体购自德国Calbiochem公司;Ultra SensitiveTM S-P超敏浓缩(兔)试剂盒(KIT-0100R),购自福州迈新生物技术开发有限公司;LI-9032/9033DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;DNA Wizard cleanup试剂盒购自Promega公司;SssI基化酶试剂盒,10×PCR Buffer、dNTP Mixture、rTaqDNA聚合酶、DL2000 DNA分子量标准均购自TaKaRa公司;MSP引物由上海生工公司合成。
三、方法
应用免疫组化法检测142例散发性卵腺癌与44例良性卵巢肿瘤组织中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和BRCA1蛋白的表达情况;应用甲基化特异性PCR(Methylation specific PCR,MSP)检测142例散发性卵腺癌与44例良性卵巢肿瘤组织中BRCA1甲基化
四、统计学处理
应用SPSS13.0统计软件包处理数据。计数资料组间比较采用Pearson卡方检验或Fishers确切概率法进行;总体生存期(Overall survival:OS)及无病生存期(dcscaso-free survival:PFS)采用Kaplan-Meier方法计算,生存期组间比较采用log-rank检验;Cox regression模型单变量及多变量分析用于检验影响生存主要独立危险因素;P＜0.05定义为有统计学意义。
结果
一、散发性卵巢癌中BRCA1表达及甲基化与临床病理参数及患者预后的相关性:
BRCA1在卵巢癌组织中的表达明显低于卵巢良性肿瘤组织中的表达(p=0.021);BRCA1甲基化率在卵巢癌及卵巢良性肿瘤组织中分别为35.2%和22.7%,卵巢癌组织中BRCA1甲基化率高于卵巢良性肿瘤组织,但差异无统计学意义(P=0.122);卵巢癌中BRCA1低表达与BRCA1启动子区甲基化明显相关(P=0.000),然而良性肿瘤组织中BRCA1的表达与BRCA1启动子区甲基化没有相关性(p=1.000)。卵巢癌组织中BRCA1表达水平在肿瘤大小为5～10cm的患者中较高(P=0.047),此外BRCA1表达与卵巢癌中其它临床病例参数没有相关性;BRCA1甲基化率在肿瘤位于双侧的患者中较高(P=0.015),且与患者血清CA125水平相关(P=0.013),另外,虽然无统计学意义,BRCA1的甲基化率在晚期(Ⅲ～Ⅳ)卵巢癌患者中高于早期(Ⅰ～Ⅱ)患者(P=0.085),在血清CA-199水平较高的患者中高于CA-199水平较低的患者(P=0.083)。在我们的研究中BRCA1蛋白表达水平与患者的总体生存期(overall survival,OS)及无病生存期(disease-free survival,DFS)均不相关,然而在晚期卵巢癌患者中BRCA1甲基化与较好的OS(P=0.005)及DFS(P=0.007)相关,但是多因素COX回归模型显示BRCA1甲基化并不是影响预后的独立因素。
二、散发性卵巢癌中BRCA1甲基化与DNMTs表达的相关性及DNMT表达与临床病理参数及预后的相关性研究:
对于浆液性肿瘤组织,恶性肿瘤组织DNMT3a的蛋白表达水平显著高于卵巢良性肿瘤组织(P=0.001),DNMT1表达无明显变化(P=0.837),DNMT3b表达较低但差异无统计学意义(P=0.054);对于粘液性肿瘤组织,DNMT3a,DNMT3b,DNMT1的表达在卵巢癌组织中与良性肿瘤组织均无差异。DNMT1的表达与DNMT3b的表达存在弱的正相关性(r=0.195,P=0.020);DNMT的表达与BRCA1启动子区甲基化没有相关性,但是任意两种DNMT共表达或者三种同时共表达的患者BRCA1甲基化阳性率都较高;DNMT1的表达在年龄较大的患者、绝经后的患者、及肿瘤位于单侧的患者中较高(P值分别为P=0.028,P=0.000,P=0.010);DNMT3a表达与病理类型及CA125水平相关,在浆液性癌中表达阳性率最高在粘液性癌中表达阳性率最低透明细胞癌中居中(P=0.027),DNMT3a的表达与CA125的水平呈正相关趋势(P=0.044);DNMT3b的表达与淋巴结转移相关,在有淋巴结转移的患者中DNMT3b的表达较没有淋巴结转移的患者略高(P=0.027),此外,DNMT3b的表达在绝经后的患者及CA199较高的患者中较高但差异无统计学意义(P=0.090,P=0.061);DNMT3a与DNMT3b共表达的情况在肿瘤较大的患者中较多见,但差异无统计学意义,我们的数据显示DNMT1与DNMT3a共表达及DNMT1与DNMT3b共表达在单侧癌中更常见(与双侧癌相比P值分别为P=0.036,P=0.015);生存分析数据显示虽然无统计学差异DNMT1、DNMT3b阳性表达的患者有较好的生存状态,DNMT1与DNMT3b共表达的患者OS较其他患者好(P=0.014),但是多因素COX回归模型显示DNMT的表达并不是影响预后的独立因素。
结论
BRCA1蛋白表达作为散发性卵巢癌中一个生物学标志应用于临床预后估计及指导临床治疗可能并不理想;BRCA1启动子区甲基化作为生物学标志在临床预后估计及治疗中可能会具有较重要的临床意义;DNMT1、DNMT3a、DNMT3b三种DNA甲基转移酶在维持DNA甲基化的过程中可能是共同合作发挥作用的;我们的数据不支持DNMT抑制剂尤其是抑制DNMT表达的寡核苷酸MG98应用于临床卵巢癌的治疗。