【摘 要】
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鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前DEV的研究已经进入
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鸭病毒性肠炎(Duck Viral Enteritis,DVE)是由鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)引起的鸭、鹅和天鹅等水禽的一种急性、接触传染性的疱疹病毒感染。目前DEV的研究已经进入基因组时代,截至目前至少已克隆出41个完整的DEV ORF。本研究以克隆的DEV gH与UL24基因为出发点,对DEV gn与UL24蛋白的特性进行初步研究。重组DEV gH与UL24基因杆状病毒的构建:根据已发表的DEV gH与UL24基因序列,设计引物p1/p2、p3/p4与p5/p6并以DEV核酸为模板克隆gH(2505bp)与UL24(1230bp)基因。其中将gH基因分为互相重叠的两个片段gH1与gH2,用引物p1/p2扩增gH1基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-gH1;引物p3/p4扩增gH2基因。用XhoⅠ与SfcⅠ双酶切pMD18-T-gH1,sfcⅠ与KpnⅠ双酶切gH2,最后将这两段酶切产物与pBlueBacHis2A连接,成功构建了重组杆状病毒转移载体pBlue-gH。用p5/p6扩增UL24基因并将该基因连接pMD18-T载体构建克隆载体pMD18-T-UL24,用XhoⅠ与EcoRⅠ双酶切pMD18-T-UL24,将酶切产物与pBlueBacHis2A连接,构建重组杆状病毒转移载体pBlue-UL24。分别将鉴定为阳性的重组质粒纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经3轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组杆状病毒。gH蛋白细胞定位:将gH基因扩增产物连接pMD18-T构建克隆载体pMD18-T-gH,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别用HindⅢ与EcoRⅠ双酶切,构建重组真核表达载体pcDNA-gH。将纯化的阳性重组质粒用脂质体法转染293细胞,并用该纯化质粒免疫BALB/c鼠以制备抗gH蛋白血清。间接免疫荧光试验表明,实现了DEV gH蛋白在体外的瞬时表达,并发现该蛋白定位于细胞外膜。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA,gH基因特异性引物进行RT-PCR检测,结果出现目的条带,进一步证明了gH蛋白在体外的表达。UL24蛋白细胞定位:根据已发表的UL24基因序列,设计引物p7/p8以DEV核酸为模板进行扩增。将扩增后的目的基因亚克隆至pEGFP-C1载体中,构建重组表达载体pEGFP-UL24,将鉴定为阳性的重组质粒纯化并用脂质体法转染293细胞。用荧光显微镜观察pEGFP-UL24在体外表达,且观察UL24蛋白定位于细胞核。将转染细胞用Trizol法提取细胞总RNA,UL24基因特异性引物进行RT-PCR检测,结果出现特异性的条带,进一步证明了UL24蛋白在体外的表达。
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