论文部分内容阅读
目的： PAC1是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽(Pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide，PACAP)的特异性受体，属于B族G蛋白偶联受体，介导PACAP的神经递质、神经调质、神经保护及调控神经再生等生物学功能，其生理性及病理学高表达与其所介导的保护细胞、抗细胞氧化损伤及抗细胞凋亡作用密切相关。Tet-on表达调控系统是目前最理想应用最广泛的真核生物基因表达调控系统，能够高效、严格地调控目的基因的表达。为了深入了解PAC1的功能，构建PAC1可调控表达的细胞系，本课题通过优化的Tet-on真核表达调控系统实现PAC1在中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞的强力霉素(doxycycline，Dox)依赖的可控表达，初步探讨PAC1的表达水平与其所介导的细胞增殖活性和抗凋亡活性之间的关系。方法：通过对实验室保存的质粒pEYFP-PAC1-EYFP进行双酶切得到编码PAC1和增强型黄色荧光蛋白(EYFP, enhanced yellow fluorescent protein)的融和基因PAC1-EYFP，将融和基因PAC1-EYFP克隆到四环素反应元件pTRE-Tight载体上，获得重组表达载体pTRE-PAC1-EYFP；基因测序鉴定正确后将改进后新型的四环素调节元件载体pTet-on advanced和反应元件载体pTRE-PAC1-EYFP依次转入CHO细胞中；遗传霉素G418和潮霉素(Hygromycin)依次筛选含有两个元件的阳性克隆PAC1-Tet-CHO，使用梯度浓度四环素衍生物强力霉素Dox诱导PAC1-EYFP表达，48h后荧光观察及Westernblot检测PAC1表达水平，并通过检测不同表达水平PAC1-EYFP的细胞增殖活性和抗缺血清诱导凋亡活性及相关指标，包括胞内第二信使cAMP基础水平，抗凋亡蛋白Bcl-2（B celllymphoma/leukemia-2）的表达水平与凋亡蛋白Caspase-3的活性等，尝试揭示PAC1不同表达水平与其所介导的细胞增殖活性和抗凋亡活性之间的关系。结果：本研究利用Tet-on表达调控系统，成功地构建了重组表达载体pTRE-PAC1-EYFP，并成功筛选出抗G418和抗潮霉素的细胞系PAC1-Tet-CHO。荧光检测和Westernblot结果显示，PAC1-Tet-CHO细胞系可实现Dox依赖的PAC1-EYFP可控表达、并且具有良好诱导性及传代稳定性。PAC1-Tet-CHO细胞系在传10代后仍能稳定地可控表达PAC1-EYFP。流式细胞术，ELISA以及MTT法检测不同表达水平PAC1-EYFP细胞的增殖活性和抗缺血清诱导凋亡活性及相关指标的结果均显示：在正常培养条件下，PAC1-EYFP表达水平越高，细胞增殖活性越强，具有较高的胞内cAMP水平；而在缺血清培养条件下，即没有PAC1配体激活的情况下，PAC1-EYFP表达水平高的细胞具有较高的抗凋亡活性、较高的细胞残留活性以及较高的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平和较低的凋亡蛋白Caspase-3的活性；显示了PAC1可赋予CHO细胞其表达水平依赖的增殖活性和抗缺血清诱导凋亡活性，并且PAC1可能具有非配体依赖激活的抗凋亡固有活性。结论：本研究通过Tet-on表达调控系统成功构建了Dox依赖的PAC1可控表达系统，发现PAC1具有赋予细胞其表达水平依赖的细胞增殖活性和抗缺血清诱导凋亡的活性，并显示PAC1具有非配体依赖激活的固有活性。研究结果不仅助于阐明过表达PAC1的生理学与病理学的作用机理，而且为以PAC1为靶点的药物开发提供新的研究平台和理论依据。