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肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是以运动神经元渐进性丢失为特点的神经退行性疾病,机体患病后出现运动功能异常。周围神经是连接神经元和肌肉的桥梁,健康的周围神经能保证机体正常的物质和信息交换。当周围神经出现损伤时,会导致运动功能障碍,严重可能引起瘫痪。在ALS病程发展中,中枢系统运动神经元出现选择性的死亡,四肢肌肉也出现渐进性萎缩,周围神经作为神经元和肌肉的连接的桥梁,其在ALS病程中扮演的重要作用显而易见。而在对肌萎缩侧索硬化的研究,大多数的研究重点都关注中枢系统的改变,而对于周围神经系统的改变和影响却很少被关注。因此,我们通过对SOD1-G93A转基因小鼠周围神经的观察和实验,来探究肌萎缩侧索硬化中周围神经的改变。第一部分突变的SOD1基因对周围神经的影响目的:本研究通过对不同时期SOD1-G93A转基因小鼠周围神经形态学的观察,同时检测在周围神经中髓鞘和轴索相关基因和蛋白的表达,来探讨突变的SOD1基因对周围神经的影响。方法:本研究通过PCR扩增的方法来鉴定转基因小鼠,并将实验小鼠分为SOD1-G93A转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠两组。第一,选择出生后15天和出生后30天的转基因和同窝对照小鼠,观察小鼠坐骨神经的超微结构,并用实时定量PCR测定出生后30天小鼠坐骨神经中髓鞘相关基因的mRNA含量。第二,选择观察出生后症状前期(60天),症状早期(90天)和症状晚期(120天)转基因和同窝对照小鼠坐骨神经的超微结构。第三,用蛋白质印迹法和免疫荧光方法观察在症状晚期(120天)转基因和同窝对照小鼠坐骨神经中轴索和髓鞘的改变。第四,用转棒实验和步幅实验来观察SOD1-G93A小鼠症状晚期(120天)的行为学改变。结果:1.应用电镜和甲苯胺蓝染色的方法,对出生后15天和出生后30天的SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠的周围神经形态学进行观察。并统计在周围神经发育的两个时期坐骨神经髓鞘形成的情况,SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠髓鞘形成并无百分比上的差异。此外,对出生后30天SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠对髓鞘和轴索的厚度进行了统计,发现SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠在髓鞘厚度上也不存在差异。2.应用实时定量PCR的方法,观察出生后30天时SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠周围神经中髓鞘相关基因,研究发现两组小鼠mRNA的表达没有统计学意义。这个结果也表明,突变的SOD1基因并不影响周围神经的发育。3.应用电镜和甲苯胺蓝染色的方法,对出生后60天和出生后90天的SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠的周围神经形态学进行观察。经过统计发现,在出生后90天时,SOD1-G93A转基因小鼠坐骨神经出现了相当比例的髓鞘和轴索变性,而同窝对照小鼠周围神经则相对完好。4.应用电镜和甲苯胺蓝染色的方法,对出生后120天的SOD1-G93A转基因和同窝对照小鼠的周围神经形态学进行观察。在出生后120天时,SOD1-G93A转基因小鼠坐骨神经损伤严重。5.应用荧光染色的方法,发现出生后120天SOD1-G93A转基因小鼠坐骨神经髓鞘相关蛋白和轴索相关蛋白表达下降明显。应用蛋白质印迹法,与同窝对照小鼠的坐骨神经相比,在出生后120天SOD1-G93A转基因小鼠坐骨神经中也观察到轴索相关蛋白的表达量下降。。6.通过转棒实验和步幅实验,发现SOD1-G93A小鼠在症状晚期运动功能下降,步幅减小。结论:在坐骨神经发育的过程中,突变的SOD1基因并不影响坐骨神经髓鞘的正常形成。而坐骨神经在SOD1-G93A小鼠的病程中出现了进展性的损坏。特别是在SOD1-G93A小鼠在出生后120天,髓鞘和轴索均出现明显变性。第二部分SOD1-G93A小鼠症状晚期(120天)周围神经的改变及突变的SOD1基因对周围神经再生的影响目的:本研究的目的是通过观察SOD1-G93A小鼠症状晚期的行为学,研究突变的SOD1基因在周围神经中对炎症和血神经屏障的影响,并检测SOD1-G93A转基因小鼠周围神经的凋亡状态。此外,在给予SOD1-G93A转基因小鼠周围神经急性损伤干预后,观察突变的SOD1基因对周围神经再生的影响,以探究在周围神经再生中突变的SOD1的作用。方法:用荧光染色方法来观察SOD1-G93A转基因小鼠症状晚期和同窝对照小鼠坐骨神经中炎症相关因子的表达。取材前24小时给SOD1-G93A转基因小鼠和同窝对照小鼠腹腔注射伊文思蓝染料,观察转基因小鼠周围神经的血神经屏障破坏情况。用Tunel试剂盒对转基因小鼠和同窝对照小鼠坐骨神经凋亡情况进行检测。此外,在实验中我们对30天的SOD1-G93A和同窝对照小鼠给予周围神经急性损伤干预后,应用电镜对两组小鼠在损伤后7天和28天周围神经的超微结构进行了观察。同时应用BrdU染色,观察损伤7天时两组小鼠施万细胞的增殖情况。在小鼠周围神经损伤7天时,我们应用实时定量PCR观察周围神经炎症相关基因和髓鞘损伤相关基因的mRNA表达量。此外,应用荧光染色方法观察了损伤7天时,两组小鼠炎症细胞的招募情况。结果:1.应用荧光染色的方法,与同窝对照小鼠坐骨神经相比,发现在120天SOD1-G93A转基因小鼠周围神经中炎症相关因子CD68,MCP-1,CD86,TGF-β的表达量增高明显。2.在对小鼠注射了伊文思蓝染料之后,我们发现SOD1-G93A小鼠周围神经中血神经屏障出现了进展性的损坏。在对小鼠周围神经中施万细胞的凋亡状态进行观察。与同窝对照小鼠相比,SOD1-G93A小鼠坐骨神经凋亡明显。3.在SOD1-G93A转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠被给予周围神经急性损伤干预后第七天,应用实时定量PCR的方法,发现同窝对照小鼠在周围神经急性损伤后能够招募更多的炎症细胞。同时,实时定量PCR结果也显示,同窝对照小鼠髓鞘损伤相关基因增高明显。4.在SOD1-G93A转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠被给予周围神经急性损伤干预后第七天,应用BrdU染色,与SOD1-G93A转基因小鼠相比,同窝对照小鼠周围神经中施万细胞增殖明显。5.在SOD1-G93A转基因小鼠和同窝非转基因对照小鼠被给予周围神经急性损伤干预后第28天,应用电镜观察两组小鼠坐骨神经的超微结构。统计结果显示,与SOD1-G93A小鼠相比,同窝对照小鼠能够形成更多有髓纤维。结论:在SOD1-G93A小鼠症状晚期坐骨神经发生严重炎症反应,血神经屏障破坏明显。同时,这个时期的SOD1-G93A小鼠坐骨神经出现明显的凋亡水平提高。在对SOD1-G93A小鼠周围神经给予急性损伤干预之后,发现突变的SOD1基因影响小鼠周围神经再生。第三部分FGF9基因施万细胞敲除对SOD1-G93A小鼠周围神经的影响目的:本研究通过对SOD1-G93A模型小鼠周围神经施万细胞中FGF9基因的敲除,观察在SOD1-G93A小鼠周围神经损伤发生时FGF9的作用。方法:应用荧光染色观察正常对照小鼠周围神经施万细胞中FGF9的表达。通过多次杂交的方法获得SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre和SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠。运用实时定量PCR方法观察FGF9在周围神经中的敲除效率。应用荧光染色和实时定量PCR方法,检测SOD1-G93A;Fgf9 fl/fl;P0-cre和SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠周围神经炎症因子的分泌情况。用电镜去观察两组小鼠周围神经的超微结构,统计轴索的损伤情况。应用Tunel染色,检测SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre和SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠周围神经的凋亡状态。结果:1.通过荧光染色,发现在普通小鼠周围神经中FGF9有很强的表达。并且mRNA的结果显示,发生敲除之后FGF9表达量在坐骨神经中下降。2.通过荧光染色和实时定量PCR,发现SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre和SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠坐骨神经在120天都有大量的炎症相关因子分泌。SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠周围神经能够招募更多的炎症细胞和分泌更多的炎症因子。3.对SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre和SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠坐骨神经超微结构进行观察,统计发现SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre小鼠周围神经损伤较轻,保留更多的轴索。4.应用Tunel染色,与SOD1-G93A;Fgf9fl/fl;P0-cre小鼠周围神经相比,发现SOD1-G93A;Fgf9fl/fl小鼠周围神经凋亡更加显著。结论:通过敲除SOD1-G93A小鼠的周围神经施万细胞中的FGF9,我们发现FGF9在周围神经损伤时能够招募更多的炎症因子,FGF9加剧了周围神经的变性。