论文部分内容阅读
目的：在体外实验中研究利用RNA干扰技术沉默EphrinB2基因对结直肠癌生物学行为的影响，并探讨其可能的机制，为结直肠癌的早期诊断和基因治疗提供理论依据和实验基础。方法：用Western Blot与RT-PCR分别检测SW480、SW620、LOVO、HT29细胞中EphrinB2蛋白及mRNA表达水平筛选出高表达EphrinB2的结直肠癌细胞SW480；将三个干扰质粒（Psilencer2.1-E65，Psilencer2.1-E376，Psilencer2.1-E730）转染293T细胞（外筛），用RT-PCR和Western Blot检测EphrinB2mRNA和蛋白的表达情况，筛选干扰效果最好的干扰质粒；然后转染入高表达EphrinB2的结直肠癌细胞（内验），将实验分3组：①空白对照组（CON）：不转染质粒②阴性对照组（NC）：转染阴性质粒③RNA干扰组（RNAi）：转染pSilencer2.1-EphrinB2-shRNA376；流式细胞仪检测各组细胞凋亡，筛选建立稳定转染细胞株；对上述3组细胞采用Western Blot与RT-PCR分别检测EphrinB2、VEGF、CD105、MMP9蛋白及mRNA的表达水平；用流式细胞仪检测各组细胞周期变化，用Transwell实验检测各组细胞侵袭能力的变化，用划痕实验测定各组细胞运动能力，MTT实验检测各组细胞的增殖率。结果：结肠癌SW480细胞中EphrinB2表达水平最高；用293T细胞外筛实验结果提示：含Psilencer2.1-E376干扰序列的质粒干扰效果最好(EphrinB2蛋白表达量显著减少)；成功将沉默效果明显的pSilencer2.1-EphrinB2-shRNA376转染至SW480细胞,流式细胞仪测细胞凋亡百分比CON组（1.97±0.47）及NC组（1.74±0.36）较RNAi组（26.69±0.66）明显降低（P<0.05）；建立稳定转染细胞株；与CON组、NC组比较RNAi组SW480细胞EphrinB2、VEGF、CD105、MMP9的蛋白及mRNA表达水平均明显下降（P<0.05），而CON组与NC组比较差异无显著性（P>0.05）；流式细胞仪检测细胞S期细胞百分比RNAi组（18.32±0.38）较CON组（25.22±0.89）及NC组（24.34±1.26）明显降低（P<0.05），G1期细胞百分比RNAi组（74.49±1.55）较CON组（55.98±1.66）及NC组（57.78±2.22）明显增高（P<0.05）；Transwell实验结果显示：RNAi组穿膜细胞数量（37.33±5.51）较CON组（109±4.36）及NC组（102±4.58）明显减少（P<0.05）；划痕实验结果显示：RNAi组迁移距离（18.33±0.71）较CON组（32.7±1.25）及NC组（30.57±1.36）明显缩短（P<0.05）；MTT实验结果显示：RNAi组细胞增殖水平较CON组及NC组明显降低（P<0.05）。结论：RNAi干扰技术能有效沉默EphrinB2基因。沉默EphrinB2基因可明显降低SW480细胞中EphrinB2蛋白和mRNA的表达，增加细胞凋亡，体外实验证实沉默EphrinB2基因抑制了结肠癌SW480细胞的肿瘤血管生成，增殖、侵袭、迁移。EphrinB2可能通过调控VEGF和MMP9在结直肠癌中发挥促进肿瘤血管生成和侵袭、转移的作用。