研究背景与意义结直肠癌(CRC)居全世界恶性肿瘤发病率的第三位、死亡率的第三位,每年新发病例约120万人,预计死亡比例超过60万人。近几年来,随着我国医疗卫生和新近诊疗技术的不断发展,结直肠癌患者的治疗有了很大程度上的提高,但是患者的生存率依然没有得到明显的改善,其主要因素是一半以上的结直肠癌患者于根治术施行之前已然发生了微小转移,复发、转移等是结直肠癌患者术后死亡的主要原因。肿瘤细胞的生长、侵袭和转移,均依赖于机体微环境因素对肿瘤侵袭性生物学行为精确而细致的调度。微环境细胞外基质、细胞成分以及细胞因子的动态平衡,可以形成独特的空间分布与网络调控模式,影响肿瘤细胞的存活、增殖、分化与侵袭,甚至发生转移。其中,参与免疫调节的细胞(如骨髓源性的巨噬细胞和中性粒细胞)分泌的细胞因子对于微环境最重要的不利影响是,直接或间接地介导了微环境的细胞免疫抑制,抑制了细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL;CD8+T 细胞)和自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)的功能。机体微环境细胞免疫功能的状态决定了肿瘤细胞的存亡。因此,详细了解肿瘤微环境中的细胞免疫状态,阐明机体微环境如何调节结直肠癌细胞的存活、增殖、分化与侵袭、转移机制,阻断肿瘤细胞生长过程中对微环境的抑制因素,将有利于促进人类探索出有效地抗肿瘤策略。干扰素(interferons,IFN)是较早应用于肿瘤免疫治疗的细胞因子之一。I型干扰素包括IFNα和IFNβ等,主要由巨噬细胞、浆样DCs和成纤维细胞产生,两种干扰素与同一种受体结合,生物学活性相同;肿瘤微环境中的成纤维细胞、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是IFNα和IFNβ的主要来源。ISG15是IFN刺激淋巴细胞后上百种表达蛋白之一,由ISG15基因编码,在IFNα、IFNβ和IFNy的刺激下均表达,但以IFNβ刺激表达增强更为明显。淋巴细胞表达ISG15分泌到细胞外基质,其分泌机制不清,相应受体与细胞外转运形式仍未确定。B7H4是属于B7蛋白家族的一种淋巴细胞功能抑制分子,目前尚未确定其结合受体,细胞免疫抑制途径亦不清楚。ISG15、B7H4在肿瘤免疫中的作用近几年来才出现相关报导,仍未取得突破性的进展,其中Abadi等的研究发现基因敲除的B7H4小鼠能够抑制乳腺癌的肺转移,认为宿主间质细胞表达B7H4通过诱导g-MDSCs抑制细胞免疫值得重视,为微环境细胞免疫抑制研究提供了借鉴,但肿瘤细胞高表达B7H4所诱发的免疫抑制仍未解决。我们发现,IFNβ刺激组与对照组相比,Balb/c小鼠皮下成瘤能力增加,肿瘤细胞凋亡减少,与T细胞共培养可以抑制其杀伤能力,同时促使结直肠癌细胞同时高表达蛋白ISG15和B7H4。我们通过免疫组化检测649例具有11年随访资料的结直肠癌组织标本,发现ISG15高表达的结直肠癌患者预后不良。筛选肿瘤细胞抗原递呈和共刺激信号等相关分子,发现IFNβ作用于结肠癌细胞后,B7H4的表达上调。用高表达ISG15的蛋白上清致敏DC细胞,可以导致ICAM-1表达上调,而高表达B7H4或ISG15/B7H4同时过表达的蛋白上清致敏DC细胞,却使ICAM-1表达下调。ICAM-1/LFA-1是介导DC细胞抗原提呈过程的重要机制,影响ICAM-1的表达可能会导致T细胞不能有效地接受DC细胞提呈的抗原。本课题组通过构建Balb/c小鼠皮下瘤模型、腹腔注射小鼠结肠癌细胞CT26.WT致结肠癌模型,模拟自然的结直肠癌发生、发展与机体微环境的相互作用,探讨结直肠癌对机体细胞免疫的抗原提呈、免疫细胞活化与免疫效应的影响以及ISG15和B7H4之间的联系。由此推测,IFNβ/ISG15/B7H4可能参与了抑制细胞免疫,促进结直肠癌细胞的生长与侵袭。材料和方法1.临床标本收集搜集649例具有11年完整随访资料的临床结直肠癌组织标本,经过经验丰富的病理医生证实病变却为结直肠癌。所获取标本的患者未经过任何放、化疗治疗。2.细胞培养技术人源性结直肠癌细胞株 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo,膀胱癌细胞株umuc、淋巴瘤细胞株Lyl0、鼠源性结直肠癌细胞株CT26.WT,均使用培养基RPMI1640(含10%胎牛血清)培养;肺癌细胞株Glc-2使用高糖培养基DMEM培养;宫颈癌细胞株HeLa使用培养基MEM培养;鼠源性树突状细胞(Dendritic cells,DCs)使用含有粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF,5Ong/ml)、白介素-4(IL-4,25 ng/ml)的RPMI-1640(含10%胎牛血清)培养,条件一致为37 ℃、5%C02、适当湿度条件下的培养箱中培养。3.Western Blot(WB)细胞培养至适当密度,胰酶消化后,收集细胞沉淀提取蛋白上清,使用凯基BCA蛋白含量检测试剂盒检测蛋白浓度,进行蛋白电泳、转膜、5%牛奶封闭、一/二抗孵育、化学发光。4.细胞功能学实验流式细胞学检测细胞凋亡、免疫细胞表面标记物。5.动物实验将CT26.WT/Blank、IFNIβ刺激的CT26.WT/IFNβ,两种细胞做以下三种处理:皮下注射、腹腔注射、盲肠浆膜下注射,接种在Balb/c小鼠体内。每组7只,SPF级别环境下饲养。6.免疫组化将上述步骤中所获取的肿瘤组织标本,经福尔马林固定后,脱水,石蜡包埋,切片,按照免疫组化的操作方法,检测ISG15的表达水平。7.统计学分析实验数据使用SPSS 17.0软件做统计学分析,P值<0.05,差异具有统计学意义。结果1.结直肠癌组织中ISG15的表达:(1)20例结直肠癌组织与配对的正常肠粘膜上皮组织,免疫组化检测ISG15的表达水平,结果显示:癌组织中ISG15高表达。(2)649例具有11年完整随访资料的结直肠癌临床标本,检测ISG15在肿瘤组织中的表达水平,并结合患者的临床病例特点做相关性分析。免疫组化结果显示:ISG15水平的高表达与临床病例的不良预后密切相关(P<0.05,差异具有统计学意义)。2.ISG15在结直肠癌细胞中的表达:选用结直肠癌细胞株 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo,提取肿瘤细胞蛋白,Western Blot检测ISG15的表达水平。结果显示:SW620、LoVo细胞中ISG15的表达水平较低。3.IFNβ刺激前后肿瘤细胞中ISG15、B7H4的表达:将细胞因子IFNβ添加至50 ml完全培养基,最终使用浓度为1000 U/ml,用该培养基培养结肠癌细胞 HT29、HCT116、LS174T、SW480、SW620、LoVo、CT26.WT,膀胱癌细胞umuc,宫颈癌细胞HeLa,肺癌细胞Glc-2,淋巴瘤细胞Lyl0,48小时后,提取肿瘤细胞蛋白,Western Blot检测结果显示:IFNβ作用48小时后,ISG15的表达显著高于对照组(除外Lyl0),B7H4在HT29、LoVo、CT26.WT中表达增高。4.IFNβ对鼠源性结直肠癌细胞生物学行为的影响:(1)与5-Fu诱导凋亡组相比,CT26.WT细胞经IFNβ刺激后,可以逆转5-Fu诱导的细胞凋亡。(2)IFNβ刺激后,SW620发生EMT转化。(3)CT26.WT细胞经IFNβ刺激后对宿主细胞免疫的影响:将对照组CT26.WT/Blank、实验组CT26.WT/IFNβ分别通过皮下、腹腔接种在Balb/c小鼠体内,构建动物模型。提取小鼠骨髓DC细胞、脾脏分选T细胞,与CT26.WT细胞共培养检测细胞凋亡,结果显示:实验组肿瘤细胞凋亡率下降,说明IFNβ刺激肿瘤细胞后,可以抑制T细胞对CT26.WT的杀伤力,影响宿主的细胞免疫。(4)ISG15、B7H4高表达对DC细胞抗原递呈的影响分别将ISG15、B7H4的空载、过表达质粒转染CT26.WT细胞后,提取蛋白上清致敏DC细胞,再与正常的T细胞共培养,Western Blot检测DC细胞表面分子ICAM-1的表达,结果显示:B7H4过表达及ISG15/B7H4同时过表达可导致ICAM-1表达下调,单独ISG15过表达反而使ICAM-1表达上调。结论1.IFNβ促使结直肠癌细胞高表达ISG15和B7H4。2.ISG15在结直肠癌组织中高表达,与患者的不良预后相关。3.IFNβ刺激后,SW620发生EMT转化。4.IFNβ可能通过增加肿瘤细胞ISG15、B7H4的表达,影响DC细胞表面分子ICAM-1的表达和抗原递呈,从而抑制宿主的细胞免疫。