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本文共分两部分。第一部分介绍了枯草芽孢杆菌中生物素/硫辛酸结合蛋白的核磁共振研究情况。第二部分介绍了果蝇中RNA剪切因子sans-fille的研究情况。
1.生物素/硫辛酸结合蛋白的核磁共振研究。
生物素修饰(biotinylation)是指生物素分子在生物素蛋白连接酶(BPL,biotinproteinligase)催化下以共价键方式连接到一类含有生物素结合结构域(biotinyldomain,约70-80个氨基酸残基)的蛋白上。硫辛酸修饰(lipoylation)是指硫辛酸分子在硫辛酸蛋白连接酶(LPL,lipoylproteinligase)催化下以共价键的方式连接到一类含有硫辛酸结合结构域(lipoyldomain,约70-80个氨基酸残基)的蛋白上。生物素结合结构域和硫辛酸结合结构域在结构上非常相似,但是未见天然蛋白被这两种酶都识别的报道。我们在Bacillussubtilisstr.168菌株中发现了一个73个氨基酸残基的独立蛋白(NP_570905),它既能够被生物素修饰,又能被硫辛酸修饰。我们称之为BLAP(biotin/lipoylattachmentprotein)。我们用核磁共振方法解析得到了BLAP在结合生物素前后的溶液结构。我们发现结合到蛋白上的生物素分子被束缚到蛋白表面。与前人的研究结果不同,我们用氨基酸突变试验证实生物素被束缚到蛋白上不是由于生物素与蛋白中的突出的loop作用(BLAP中没有这个loop),而是由于生物素与结构中特殊位置的芳环作用造成的。我们也研究了BLAP被硫辛酸修饰后的溶液构象,连接到蛋白上的硫辛酸也被束缚在蛋白表面。我们对BLAP蛋白结合生物素前后的主链动力学运动特性进行了核磁共振研究。BLAP的动力学数据与结构和功能有很好的相关性:有明显的构象交换的Lys35恰好是发生生物素和硫辛酸修饰时的作用位点。Tip12附近也存在弱的构象交换,而此区域也恰好是结合到蛋白上的生物素和硫辛酸被束缚的区域。通过结构分析,我们提出了生物素修饰和硫辛酸修饰的底物选择性模型。
2.果蝇中RNA剪切因子Sans-Fiile(SNF)的核磁共振研究
Snf(Sans-fille)来自于Drosophilamelanogaster,是非常重要的RNA剪切因子,它在氨基酸序列上同人类RNA剪切因子U1A和U2B"蛋白有很高的同源性。
SNF相当于人类U1A和U2B"蛋白,它既象U1A能结合U1snRNA(smallnuclearRNA),又象U2B"能结合U2snRNA。此外SNF还参予Sxl(Sex-lethal)的变位剪切,从而间接对果蝇的性别发育进行调控。我们克隆了SNF及其N端和C端的结构域(RBD1,RBD2),并且分别将它们在E.coli中进行了高效表达。我们采用非RNA酶法纯化SNF,得到了大于95﹪纯度的样品。我们还将SNF的稳定性由2-3天提高到1个月,而降解总量不超过10﹪。我们探索了SNF进行核磁共振研究的最佳浓度和温度条件,完成了SNF蛋白的主链核磁共振信号归属并且研究了SNF的核磁共振主链动力学运动特性,发现SNF可能是以N端结构域二聚的形式存在。我们用核磁共振方法得到了SNFRBD2(C端结构域)的溶液结构。通过比较,我们发现SNFRBD2之所以不能结合snRNA就是因为它缺少C末端的一个小的a-螺旋结构。我们还克隆了不同长度的SNFRBD1,并且对SNFN123(N端123个残基的SNFRBD1)进行了主链和侧链原子的化移归属,进一步补充和修正了SNF主链化学位移归属。我们分析了SNFN123在进行结构计算时遇到的困难,并提出了相应的解决方案。