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研究背景与目的肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是一种预后较差的世界性恶性肿瘤,由于缺乏有效的HCC治疗策略和患者生存率低,目前对于肝细胞癌的有效治疗仍然面临巨大的挑战。因此,有必要研究新的肿瘤相关分子,为肝癌生物标志物的开发和免疫治疗提供靶点。肿瘤睾丸抗原(Cancer testis antigen,CTA)由于其自身的特点,已成为一种潜在的针对各种恶性肿瘤免疫治疗的临床生物标志物。研究发现CTA在包含HCC的多种类型恶性肿瘤中表达,且能够诱导肿瘤细胞发生上皮间充质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT),从而参与肿瘤的转移过程。FATE/BJ-HCC-2是利用生物信息学方法发现及实验室验证的一种CT抗原基因。前期研究表明,FATE/BJ-HCC-2高表达于HCC,而在肝硬化和正常肝组织中不表达。本课题通过构建稳定过表达FATE/BJ-HCC-2基因的肝癌细胞株,探讨FATE/BJ-HCC-2基因过表达对肝癌细胞恶性生物学行为的影响,初步探索FATE/BJ-HCC-2基因表达在肝细胞癌中的生物学作用。研究方法1.Western blot技术检测FATE/BJ-HCC-2基因在肝癌细胞系中的蛋白表达情况;qRT-PCR技术进一步检测FATE/BJ-HCC-2基因mRNA表达水平。2.构建FATE/BJ-HCC-2基因过表达载体,并将构建成功的过表达载体通过慢病毒转染的方式转染肝癌细胞,并验证其过表达效果。3.CCK8和克隆形成实验检测FATE/BJ-HCC-2基因对肝癌细胞体外增殖的影响,细胞划痕实验和Transwell实验检测FATE/BJ-HCC-2基因表达对肝癌细胞体外迁移侵袭能力的影响;动物实验检测FATE/BJ-HCC-2基因表达对体内肿瘤生长的影响。4.qRT-PCR和Western blot技术检测FATE/BJ-HCC-2基因表达上调后EMT相关标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin的表达情况。qRT-PCR法检测启动EMT相关转录因子Snail、Slug基因的表达量。5.Western blot技术检测FATE/BJ-HCC-2基因表达上调可能影响有关信号通路分子蛋白的表达情况。结果1.以非恶性肿瘤细胞LO2为对照,在核酸和蛋白质水平检测发现FATE/BJ-HCC-2基因在Huh7、SNU449肝癌细胞中相对低表达,在SMMC7721、HepG2、Hep3B肝癌细胞中表达量相对较高。2.过表达FATE/BJ-HCC-2基因的质粒构建成功,用构建成功的pLV-CMV-FATE/BJ-HCC-2-3FLAG-EGFP 和 pLV-CMV-NC-EGFP 慢病毒载体转染 Huh7、SNU449 细胞,Western blot 和 qRT-PCR 实验结果显示 FATE/BJ-HCC-2的蛋白表达水平和mRNA表达水平均显著提高。3.FATE/BJ-HCC-2基因表达上调能够促进肝癌细胞Huh7、SNU449的体外增殖、迁移侵袭能力,裸鼠荷瘤实验发现FATE/BJ-HCC-2基因表达能够促进肿瘤的生长。4.FATE/BJ-HCC-2基因表达上调后,上皮型标志物E-cadherin表达量下调,间充质标志物N-cadherin、Vimentin表达量上调,转录因子Snail、Slug基因mRNA表达水平显著提高。5.FATE/BJ-HCC-2基因可能是通过wnt/β-catenin信号通路诱导肝癌细胞发生EMT,从而影响HCC的发展。结论1.FATE/BJ-HCC-2基因过表达能够促进肝癌细胞的体外增殖和克隆形成,增强肝癌细胞的体外迁移侵袭能力。2.动物实验显示FATE/BJ-HCC-2基因表达上调对体内肿瘤生长具有促进作用。3.FATE/BJ-HCC-2基因能够促进启动EMT转录因子Snail、Slug表达,可能是通过wnt/β-catenin信号通路影响肝细胞癌的发展。