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雄性生殖干细胞(male germline stem cells,m GSCs)是存在于睾丸曲细精管中具有自我更新潜力和终生生精功能的干细胞。它通过自我更新和分化维持自身数目的稳定,并且通过精子的发生源源不断的产生精子。雄性生殖干细胞(m GSCs)也称精原干细胞,它在睾丸中占非常小的比例,大概在0.02%-0.03%左右,并且很难在体外长期传代培养。目前,关于小鼠精原干细胞的长期培养体系以及自我更新和分化的机制已经取得了一定的进展,但是对于家畜动物的长期培养体系及其自我更新和分化的机制研究仍然非常有限。在本研究中,我们通过转导SV40大T抗原到牛雄性生殖干细胞中,建立了一个稳定的永生化牛雄性生殖干细胞系。永生化后的m GSCs增殖明显加快。在m RNA和蛋白水平,其表达精原干细胞的特异性基因,如PLZF,PGP9.5,VASA,Lin28A和CD49F。这些细胞并能在体外被诱导分化成三个胚层的细胞类型,且具有启动减数分裂的潜力。永生化m GSC细胞系还能在白消安诱导的生精障碍小鼠的曲细精管中增殖并形成克隆。此外,我们以永生化m GSCs为研究对象,发现IGF-1信号通路对牛m GSCs的生存具有重要作用,当IGF-1信号通路被阻断时,m GSCs的增殖受到抑制,且细胞凋亡增加。在本研究中,还发现长链非编码RNA H19能够调控IGF-1信号通路,从而调控了m GSCs的增殖和凋亡。1.牛雄性生殖干细胞体外分离纯化、鉴定牛雄性生殖干细胞通过THY1(又名CD90)抗体磁珠分选纯化获得,磁珠分选后的阳性细胞GFRA-1和THY1阳性细胞率明显高于阴性细胞。经过形态学、PCR和免疫荧光染色方法鉴定,这些纯化后的细胞表达雄性生殖干细胞特异性标记基因PLZF、GFRA-1、PGP9.5(又名UCHL-1)、LIN28A,生殖细胞标记基因:VASA,多能性标记基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4,自我更新标记基因ETV-5。这些结果表明,我们所分离纯化的细胞符合雄性生殖干细胞的典型特征。2.永生化牛雄性生殖干细胞的生物学特性鉴定分离纯化后的牛m GSCs通过转导含SV40大T抗原的载体(p LOX-Ttag-ires-TK),连续培养传代超过三个月实现永生化。永生化的m GSCs表现出增殖加快,对血清、细胞因子等营养物质的需求降低。经过PCR、免疫荧光染色方法和western blot方法鉴定,永生化细胞能够表达m GSCs特异性标记基因PLZF、CD49F、LIN28A、PGF9.5等。生殖细胞标记基因:VASA。多能性标记基因:OCT-4、NANOG、SOX-2、KLF-4。自我更新标记基因ETV-5。在体外分化能力检测实验中,牛m GSCs在体外诱导分化后能够表达外胚层细胞标记基因(PDX-1)、中胚层细胞标记基因(ASM)、内胚层细胞标记基因(NESTIN)的标记基因。此外,在维甲酸(RA)刺激下,永生化的牛m GSCs的减数分裂标记基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2相对于对照组表达上调,免疫荧光结果显示实验组表达减数分裂标记基因STRA8、SYCP3、DAZL、ESCO2的阳性细胞率多于对照组。3.长链非编码RNA H19通过IGF-1信号通路调控永生化牛雄性生殖干细胞的增殖与凋亡在本研究中,我们以永生化mGSCs为研究对象。通过添加不同浓度的细胞因子IGF-1(20 ng/m L、40 ng/m L、60 ng/m L),结果证实40 ng/m L的IGF-1时够显著促进m GSCs的增殖,且增殖效应呈现浓度剂量依赖关系。我们进一步采用IGF-1特异性受体抑制剂(PPP)阻断牛精原干细胞的IGF-1信号通路,通过CCK-8、EDU标记实验、western blot、流式细胞数检测细胞凋亡率等,结果发现IGF-1信号通路被阻断后牛m GSCs的增殖明显被抑制,细胞凋亡增加。进一步通过Si RNA干扰片段干扰长链非编码RNA H19后,发现IGF-1信号通路能够被抑制,细胞增殖受到抑制。本研究建立了一个稳定的永生化牛雄性生殖干细胞系,并初步探讨了长链非编码RNA H19能够调控IGF-1信号通路,并在牛雄性生殖干细胞的增殖和凋亡中发挥着重要作用,为深入研究雄性动物雄性生殖干细胞的自我更新机制奠定了一定的理论基础。