氨基酸是人体蛋白质合成最重要的底物之一,肠腔内氨基酸的跨膜转运及功能调控对机体细胞代谢,生命器官功能维护具有重要的生理意义。目前已知,肠腔内氨基酸的跨膜转运是由细胞膜上特殊的载体(transporter)来完成的。本研究拟利用分子生物学手段,从细胞水平、整体水平观察Na~+依赖性中性氨基酸载体B~0AT1/ASCT2的生物学功能,严重创伤下其重要底物-谷氨酰胺的跨膜转运特点,以及与肠内营养其它营养素的转运调控比较。为临床上严重创伤及危重症患者救治肠内营养制剂的选择提供理论依据。第一部分人类中性氨基酸载体B~0AT1的真核表达重组质粒构建及稳定转染Hela细胞系的建立目的构建可表达人中性氨基酸载体B~0AT1基因的真核表达载体,建立重组质粒转染的Hela细胞系,筛选出稳定表达人B~0AT1的细胞株。方法:提取人正常小肠上皮细胞总RNA,采用RT-PCR方法扩增出B~0AT1基因片段,EcoRI和XbaI双酶切后将其插入至真核表达载体pcDNA3.1中,构建重组表达质粒pcDNA3.1- B~0AT1,转化E. coli DH5α菌株感受态细胞,将阳性克隆脂质体法转染Hela细胞,经G418筛选获得稳定表达株,用RT-PCR法检测B~0AT1基因的mRNA表达,氨基酸摄取实验证实转染pcDNA3.1- B~0AT1的Hela细胞具有B~0AT1基因的生物学活性。结果:从小肠上皮细胞中成功克隆到人B~0AT1基因,酶切和序列测定表明已成功构建真核表达载体pcDNA3.1- B~0AT1,将此重组质粒转染的Hela细胞可稳定表达人B~0AT1基因,并筛选出稳定表达B~0AT1的Hela细胞系。结论:重组人中性氨基酸载体B~0AT1克隆成功,并在Hela细胞中获得稳定表达,为进一步研究B~0AT1的功能及其调控干预打下了良好的基础第二部分Na~+依赖性谷氨酰胺载体ASCT2的生物学功能及表皮生长因子的调控作用目的肠上皮细胞氨基酸载体对于机体营养物质吸收至关重要。Na~+依赖性中性氨基酸载体ASCT2是一种广谱的氨基酸载体,它的生理功能主要是转运肠腔内谷氨酰胺,丙氨酸,丝氨酸,半胱氨酸等中性氨基酸。本研究拟对ASCT2载体转运特性及表皮生长因子对其的调控机制作一探讨。方法体外培养肠上皮细胞系Caco-2细胞,观察ASCT2对同位素标记谷氨酰胺的转运特性、动力学特征及底物特异性;利用ASCT2多克隆抗体及TaqMan实时定量PCR方法,研究表皮生长因子对ASCT2功能的调控作用。结果Caco-2细胞中Na~+-依赖性[3H]-L-谷氨酰胺(50uM)的转运速率为635±80.1 pmol/mg protein/min,大部分中性氨基酸如丙氨酸,丝氨酸,半胱氨酸等可对其产生竞争性抑制;表皮生长因子(100ug/L)孵育下可以提高其转运活性约100%(P<0.01),western-blot及real-time PCR显示其蛋白及mRNA表达增高。结论谷氨酰胺载体ASCT2对同位素标记谷氨酰胺具有强大的转运活性,对中性氨基酸底物具有亲和特异性;表皮生长因子对其转运活性、蛋白表达、mRNA丰度具有上调作用。第三部分严重创伤对肠上皮细胞中性氨基酸载体表达的影响目的严重创伤往往引起机体多个器官与组织的蛋白质代谢的异常。临床上,这种代谢反应经常导致全身性负氮平衡。这种情况下,营养支持成为救治严重创伤及危重症患者一种重要且有效的手段。其中,肠内营养支持由于其有助于预防肠粘膜萎缩,维持肠道免疫屏障功能,维护正常菌群等特点成为首选的营养支持方式。然而,严重创伤情况下肠上皮细胞对蛋白质底物的转运功能尚不清楚。本研究拟利用肠上皮细胞系Caco-2,定量分析严重创伤情况下氨基酸的转运变化及其载体蛋白表达情况。方法体外培养肠上皮细胞系Caco-2,首先分析其细胞膜表面Na~+-依赖性中性氨基酸转运及其转运载体功能特性。将细胞置于缺氧、营养剥夺、缺血等创伤条件下继续培养1-6h,观察其刷状缘膜囊氨基酸转运及其相应转运载体蛋白、mRNA表达情况。结果Caco-2细胞膜表面Na~+-依赖性L-丙氨酸的转运速率高于L-谷氨酰胺(876+67.5 vs. 635+52.8 pmol/mg protein/min, P<0.01)。在主要的中性氨基酸载体中,仅仅成功扩增出ASCT2的mRNA条带。与对照组相比,在营养剥夺及缺血条件下,L-丙氨酸与L-谷氨酰胺的转运速率明显下降(P<0.01),而缺氧对氨基酸转运无明显影响。这种变化主要引起转运动力学Vmax下降,Km值无明显变化。与对照组相比,营养剥夺及缺血条件下相关转运载体蛋白及mRNA表达下降。结论严重创伤对Na~+-依赖性中性氨基酸转运及关键性转运载体调控特点不同。这可能对临床上危重症患者特殊的营养底物需求提供积极的理论依据。第四部分小肠低灌流大鼠模型对肠内营养物质的转运研究目的肠内营养是临床上危重症患者营养支持的首选途径。然而,在肠道低灌注情况下,肠内营养中某些特殊营养素的转运及其作用机制尚不明确。本研究拟利用小肠低灌流大鼠模型,研究谷氨酰胺、葡萄糖在肠刷状缘的转运变化,载体表达及其对组织形态学的影响。方法SD大鼠随机分为2组:1)低灌流组,肠系膜上动脉阻断60min;2)假手术组,剖腹,不阻断血流。同时在肠襻内原位灌注甘露醇、葡萄糖、谷氨酰胺。Ca2+沉淀法制备肠刷状缘膜囊;快速混合滤过法检测Na~+依赖性葡萄糖及谷氨酰胺转运;双盲观察组织形态及免疫组化。结果与对照组相比,低灌流组组织乳酸盐浓度显著增高,尤其是在葡萄糖灌注组(P<0.001)。低灌流组肠刷状缘Na~+依赖性葡萄糖的转运及其载体表达明显下降,而谷氨酰胺则未见明显变化。在低灌流组中,葡萄糖灌注引起的组织结构损害最为严重。结论肠内营养中葡萄糖及谷氨酰胺在创伤及应激情况下的转运和载体表达调控不同。第五部分缺血损伤肠上皮细胞谷氨酰胺载体的表达及重组人生长激素的调控作用目的临床工作中,营养支持已经成为严重创伤患者,尤其是重要脏器低灌注患者的重要治疗手段之一。但是,作为机体外源性营养物质吸收最重要的器官,小肠及其上皮细胞在低灌注情况下对营养物质的转运功能尚不清楚。谷氨酰胺是对小肠上皮细胞生长和发育均十分重要的营养物质。本研究拟利用肠上皮细胞系Caco-2,研究缺血损伤情况下谷氨酰胺转运及其载体的表达变化,及重组人生长激素(rhGH)的调控作用。方法在体外将肠上皮细胞系Caco-2置于缺血条件下培养2h,然后将细胞继续与生长激素(500ng/ml)共孵育0-72h。分析其细胞膜表面Na~+-依赖性谷氨酰胺转运及其转运载体蛋白、mRNA表达情况。结果缺血损伤后,Caco-2细胞膜表面Na~+-依赖性谷氨酰胺转运明显下降(P<0.01),其相应的载体蛋白表达明显下降(P<0.01)。通过在细胞腔侧及基底侧同时给予重组人生长激素的培育,谷氨酰胺转运及其载体表达可以恢复到正常水平(P>0.05)。结论缺血低灌注后Caco-2细胞中Na~+-依赖性谷氨酰胺转运及其载体表达下降,重组人生长激素对其具有上调作用。