研究背景肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension, PAH)是以肺动脉压力增高为主要特征的一类进行性疾病,其发病机制至今仍未完全阐明。血管重构是PAH发生发展的重要病理生理机制,而肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells, PASMCs)的过度增殖是引起血管重构的关键因素。血管平滑肌细胞增殖受细胞周期蛋白(cyclin)及其依赖性蛋白激酶(CDK)和CDK抑制因子(CDKI)的共同调控。p27作为一种CDK抑制因子,也参与了PASMCs增殖的调控。研究证明,在低氧性PAH鼠肺动脉p27的表达明显下调。体外实验也证明,上调或过表达p27均能够抑制PASMCs的增殖。p27对细胞增殖的调控涉及细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号途径,被激活的ERK1/2磷酸化而降解。降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide, CGRP)是感觉神经的主要递质,其水平降低可能是促进PAH血管重构的原因之一,因为在PAH动物模型中血浆CGRP水平降低,而外源性给予CGRP或过表达CGRP均可显著缓解肺动脉高压的症状。此外,细胞实验也证明,过表达CGRP能够抑制血清诱导PASMCs的增殖。然而,CGRP抑制肺血管重构的机制尚未明了。我们以前的研究证明,CGRP能明显抑制AngⅡ诱导的主动脉血管平滑肌细胞(ASMCs)的增殖,其机制与其抑制ERK1/2信号通路有关。因此,我们推测CGRP可能通过ERK1/2/p27信号通路参与了PAH血管重构的调节。方法采用低氧(10%O2)诱导PAH大鼠模型。低氧前4天大鼠皮下注射辣椒素(50mg/kg/d),用以耗竭内源性CGRP。右颈外静脉插管测定右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)。分离右心室(RV)、左心室加室间隔(LV+S)并称重,计算RV/(LV+S)比值。放射免疫法测定血浆CGRP含量。提取肺动脉RNA或蛋白,real-time PCR或Western Blot检测CGRP、p27、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、 c-fos及c-myc的表达。4%多聚甲醛固定左肺,石蜡包埋,进行HE或免疫组化染色。大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)采用组织块贴壁法制备。3%O2刺激细胞增殖。不同浓度CGRP (1、10、100nM)及CGRP受体阻断剂CGRP8-37(1μM)预孵育1h,然后低氧处理48h。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖,real-time PCR或Western Blot检测p27、p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表达。小分子干扰RAN(siRNA)细胞转染。当PASMCs汇合达到70%-80%后,采用lipofectamin2000转染试剂将p27siRNA干扰片段转入细胞,干扰p27的表达。Real-time PCR或Western Blot检测干扰效率。干扰24h后加入CGRP (100nM)继续低氧处理48h。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖,real-time PCR或Western Blot检测p27、 p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表达。结果低氧诱导PAH大鼠的RVSP、mPAP较常氧对照组显著升高；肺动脉中膜显著增厚,而用辣椒素预先耗竭内源性CGRP后能够加重低氧诱导的上述改变。PAH大鼠CGRP水平显著降低,上调肺动脉c-fos、c-myc的表达上调,而用辣椒素预先耗竭内源性CGRP后能够进一步降低CGRP水平及上调c-fos、c-myc的表达。PAH大鼠肺动脉p-ERK1/2的表达水平显著上调及p27的表达显著下调,而用辣椒素预先耗竭内源性CGRP后进一步上调p-ERK1/2的表达及下调p27的表达。在培养的PASMCs低氧显著促进细胞增殖,明显下调p27的表达及上调p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表达；外源性CGRP(1、10、100nM)可剂量依赖性的抑制低氧诱导的细胞增殖,促进p27的表达及抑制p-ERK1/2、c-fos及c-myc的表达。而CGRP的这些作用可以被CGRP阻断剂CGRP8-37所取消。p27siRNA干扰能明显抑制CGRP介导的p27表达上调,但对ERK1/2磷酸化作用不明显。同时能逆转CGRP抑制低氧诱导的PASMCs细胞增殖及c-fos、c-myc的表达。结论本实验确证了耗竭内源性感觉神经递质CGRP能够加重低氧诱导的大鼠PAH血管重构；CGRP能够抑制低氧诱导的PAH肺血管重构,其机制可能与抑制ERK1/2的磷酸化,上调p27的表达及抑制c-fos和c-myc的表达有关。研究背景肺纤维化(pulmonary fibrosis)是一种涉及多种病因的间质性肺疾病,其发病机制至今仍未完全清楚。肺成纤维细胞的增殖与活化以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的过度沉积是其主要病理特征。eIF3是真核翻译起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)家族中最大的成员之一,在蛋白翻译、细胞增殖及肿瘤的发生发展中起着重要作用。eIF3a是eIF3中最大的亚基,研究证明,eIF3a在调节肺癌细胞增殖中起重要作用。基于eIF3a在调节肺癌细胞增殖中起重要作用,以及在肺癌组织中表达较高,我们推测eIF3a可能参与肺成纤维细胞增殖的调控,与肺纤维化形成有关。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)为强效的促纤维化因子,在肺纤维化的发生发展中起着重要作用。文献报道,TGF-β1促进肺成纤维细胞增殖活化涉及ERK1/2信号途径。研究证明,TGF-β1诱导肺血管平滑肌细胞增殖与上调eIF2表达有关,而在小鼠胚胎成纤维细胞增殖分化过程中伴随着eIF2α磷酸化水平的升高。本实验拟探讨TGF-β1促进肺成纤维细胞增殖是否与上调eIF3a的表达有关,以及这一作用是否也受磷酸化的调节(如ERK1/2信号通路)。降钙素基因相关肽(CGRP)是由37个氨基酸组成的感觉神经肽。文献报道,在二氧化硅和石棉诱导的肺损伤并发肺纤维化的患者,肺组织CGRR的表达明显降低。博莱霉素诱导肺纤维化是常用的动物模型,博莱霉素诱发肺纤维化是否涉及CGRP的变化,尚未见报道。我们前期的研究发现,CGRP通过ERK1/2信号通路能够抑制AngⅡ诱导的主动脉平滑肌细胞(ASMCs)增殖及低氧诱导的PASMCs增殖,ERK1/2信号通路在肺成纤维细胞增殖活化和ECM合成增加中也起着重要作用。因此,我们推测CGRP可能通过影响ERK1/2/eIF3a途径而抑制肺成纤维细胞的增殖,进而抑制肺纤维化的形成。方法采用博莱霉素(bleomycin,5mg/kg)诱导肺纤维化大鼠模型。造模前4天大鼠皮下注射Capsaicin (50mg/kg/d),用以耗竭内源性CGRP。造模后第21天处死动物,颈动脉采血ELISA法测定血浆TGF-β1含量。提取肺组织RNA或蛋白,real-time PCR或Western Blot检测α-CGRP、β-CGRP、TGF-β1、eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、胶原Ⅰ和Ⅲ的表达。4%多聚甲醛固定左肺,石蜡包埋,进行HE、Masson及免疫组化染色。大鼠肺成纤维细胞采用胰酶消化法制备。波形蛋白免疫组化染色进行细胞鉴定。TGF-β1(5ng/ml)刺激细胞增殖。当肺成纤维细胞汇合达到70%～80%后,加入ERK1/2抑制剂PD98059(1μM)预孵育1h,然后TGF-β1继续孵育24h。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖,real-time PCR或Western Blot检测eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、胶原Ⅰ和Ⅲ的表达。小分子干扰RAN(siRNA)转染。当肺成纤维细胞汇合达到70%～80%后,采用lipofectamin2000转染试剂将eIF3a siRNA干扰片段转入细胞,干扰eIF3a的表达。Real-time PCR或Western Blot检测干扰效率。干扰24h后加入TGF-β1继续孵育24h。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖,real-time PCR或Western Blot检测eIF3a、p-ERK1/2、 α-SMA、胶原Ⅰ和Ⅲ的表达。当肺成纤维细胞汇合达到70%-80%后,加入不同浓度CGRP(1、10、100nM)及CGRP受体阻断剂CGRP8.37(1μM)预孵育1h,然后TGF-β1继续处理24h。BrdU法和流式细胞术检测细胞增殖,real-time PCR或Western Blot检测eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、胶原Ⅰ和Ⅲ的表达。结果博莱霉素诱发肺纤维化动物肺组织结构破坏,肺泡间隔增宽,炎性细胞浸润以及纤维组织增生,胶原沉积明显增多,肺组织TGF-β1、 eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ胶原表达增高。博莱霉素诱发肺纤维化动物肺组织CGRP表达显著降低,当预先用辣椒素处理(耗竭内源性CGRP)不仅进一步降低肺组织CGRP的表达,同时加重博莱霉素诱导的肺纤维化,以及肺组织TGF-β1、eIF3a、 p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ胶原表达也进一步增高。在培养的肺成纤维细胞上TGF-β1能够明显促进细胞增殖,显著上调eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ及Ⅲ胶原的表达。ERK1/2抑制剂PD98059能够明显逆转TGF-β1诱导的细胞增殖及eIF3a、p-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ胶原的表达。eIF3a siRNA干扰后能明显逆转TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖,减弱TGF-β1诱导α-SMA、Ⅰ及Ⅲ胶原的表达,但对ERK1/2的磷酸化作用则无明显影响。外源性CGRP(1、10、100nM)可剂量依赖性的抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖,明显抑制eIF3a、P-ERK1/2、α-SMA、Ⅰ和Ⅲ胶原的表达,而CGRP的这些作用可以被CGRP阻断剂CGRP8-37所取消。结论eIF3a在博莱霉素诱导的肺纤维化形成中起着重要作用；TGF-β1通过ERK1/2信号途径上调eIF3a的表达而促进肺成纤维细胞的增殖；内源性CGRP表达水平降低是加重博莱霉素诱导的肺纤维化的因素乙一；CGRP抑制肺成纤维细胞增殖涉及ERK1/2/eIF3a信号途径。