喹赛多作为新型喹噁啉类抗菌促生长饲料添加药物,与同类药物相比,具有更高的安全性。喹赛多对多种家畜家禽及水产动物均有较好的促生长作用。本实验室前期研究表明,喹赛多可提高猪体内循环GH和IGF-1的含量,能够诱导猪肝细胞IGF-1的表达量上调。GH和IGF-1位于动物激素生长轴中,可直接或间接的作用于肌肉组织,使动物整体表现出生长。那么喹赛多是否也能够直接调控直观体现动物生长的肌肉组织呢?探明喹赛多对肌肉组织有无直接作用,若有作用又是通过何种机制发挥作用,这为进一步探讨喹赛多促生长机制提供了理论依据和新思路。本研究以小鼠成肌细胞C2C12细胞系分化所形成的肌管为研究模型,首先选取了喹赛多作用细胞的最佳浓度和时间,然后通过基因芯片技术和双向电泳与质谱联用技术筛选出了喹赛多影响下差异表达的基因和蛋白质,并对喹赛多影响肌肉细胞的机制进行了初步探讨。1.喹赛多作用于C2C12肌管的最佳浓度与时间的选取本研究设置了喹赛多作用浓度梯度(1,2,4,8,12μM),通过BCA蛋白定量法分别测定了喹赛多作用C2C12肌管4h,8h,12h后的细胞总蛋白浓度。结果表明,2μM喹赛多处理细胞4h时细胞总蛋白含量相对空白对照组上调20%,统计学分析表明,差异极显著。这说明2μM、4h的药物作用浓度与时间为最佳组合,故以此条件进行差异表达蛋白的筛选。由于基因表达模式与蛋白质表达模式的时空关系不同,本研究又选取了基因指标来筛选喹赛多对细胞基因mRNA水平表达影响最为合适的作用浓度和时间。结合蛋白质定量结果,在五个梯度浓度中,8μM和12μM浓度喹赛多对C2C12细胞无促进作用,而细胞对1μM和41μM的药物作用浓度并不敏感,所以本研究直接采用2μM的药物浓度作用细胞,通过RT-qPCR技术,分别测定1h,2h,4h,6h时细胞内MyHC的nRNA表达量。结果表明4h时MyHC表达量最高,是空白组的2.4倍。故以此条件进行基因芯片分析,以实现对差异基因的检测。2.喹赛多作用C2C12肌管后差异表达的基因以2μM浓度的喹赛多孵育细胞4h,用基因芯片检测此时细胞基因组中相对于空白对照组nRNA表达量发生变化的基因。本研究共筛选出68个已知基因,其中32个基因上调表达,36个基因下调表达。对这些基因进行分析,按分子功能可将这些基因分为5类：结构组分、结合活性、酶活性、受体活性、转录活性；按生物进程可分为7类：蛋白质修饰、代谢、生物合成、调控、转录、应激、细胞生长。对C2C12肌管的生长相关基因进行分析,本研究推断,喹赛多影响肌肉细胞生长的可能机制为：一方面诱导细胞内Tceal7基因表达量上调,引发细胞进一步融合；一方面通过影响细胞内蛋白质磷酸化水平调节细胞内信号通路实现其促生长作用。此外,喹赛多还可增强细胞内nRNA转录调控活动,影响代谢相关基因差异表达,为细胞提供物质与能量。用RT-qPCR验证部分差异基因表达,各基因nRNA表达量变化趋势与芯片结果一致,证实本研究所得结果可靠。3.喹赛多作用C2C12肌管后差异表达的蛋白2μM浓度的喹赛多作用细胞4h后,经二维凝胶电泳和飞行时间质谱联用,检测发现,喹赛多处理组与空白对照组相比,有20个差异表达的蛋白鉴定成功,其中有18个表达量上调,2个下调表达。对这些蛋白的功能进行分析,差异蛋白在分子功能方面主要具备结合活性和酶活性,对其所参与的生物进程进行归类：物质与能量代谢、生物合成、细胞分化、信号转导、氧化应激。烯醇化酶Enol在喹赛多作用下的C2C12肌管中上调表达,细胞内骨架相关蛋白和肌肉分化相关蛋白均出现上调,预示喹赛多可能促发C2C12肌管重塑,进一步融合形成更为粗大的肌纤维。在喹赛多作用下,细胞内超氧化物歧化酶Sodl和过氧化物酶Prdx1含量增加,多种氧化应激相关蛋白上调表达,通过激活细胞内信号通路转导来应对氧化物刺激产生的不良影响。Sodl可将细胞内的自由基转化为H2O2,Prdx1可进一步清除H2O2,使细胞免受损伤。这提示喹赛多在代谢过程中可能产生了自由基,进而形成H2O2。研究表明,低浓度的H202对骨骼肌细胞内的PI3K/Akt及其它促生长相关信号通路有激活作用,是肌细胞中葡萄糖运输活化的重要调节物。我们推测,喹赛多可通过这种机制调节肌肉细胞的生长和生理功能。综上分析,本研究从分子层面阐述了喹赛多对肌肉细胞的影响及作用机制,发现喹赛多可能影响肌肉细胞的重塑与融合,促进细胞内的物质和能量代谢,改变细胞内蛋白的磷酸化水平。另外,喹赛多可能通过影响细胞内H2O2的含量,间接作用于促生长相关信号通路如PI3K/Akt,进而影响肌肉细胞的生长。