重度子痫前期是妊娠期特有的疾病，是引起孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一。虽然近几年来关于它的研究有了更深的认识，但其确切的病因至今国内外尚未阐明。因此，对于重度子痫前期发病机制的进一步探讨，已经成为国内外学者关注的焦点。　　 重度子痫前期的发病机制非常复杂，涉及到多种因素，目前普遍认为:孕早期胎盘浅着床和血管重塑障碍是重度子痫前期发病的中心环节。胎盘滋养细胞正常分化、迁移、侵袭和凋亡是胚胎着床和胎盘形成的重要保障。一旦平衡失调，将导致孕早期胎盘滋养细胞发生过度凋亡，削弱了滋养细胞的侵袭力，从而引起胎盘形成和发育的畸形，这可能是重度子痫前期发病的关键因素。因此，本次课题研究以能影响滋养细胞侵袭及凋亡生物学行为的因素作为切入点，进一步探讨重度子痫前期的发病机制。　　 转录因子激活蛋白-2α(AP-2α)是一个重要的转录因子，通过信号转导通路转录性调控其下游靶基因的表达，从而参与脊椎动物的生长发育过程;同时又因为AP-2α能影响肿瘤细胞的迁移、侵袭及细胞凋亡等功能，所以AP-2α与肿瘤的发生及发展也密切相关。SchwartZ等发现在晚期结肠癌细胞中，存在AP-2α表达缺失的现象，当采用AP-2α质粒转染结肠癌细胞系SW480时，发现SW480细胞中E-cadherin的表达增加，MMP-9的表达及活性降低，同时，也发现AP-2α能使结肠癌细胞侵袭性和致瘤性减弱的现象，这一研究结果表明，AP-2α是通过调节E-cadherin和MMP-9的表达，在结肠癌的发生及癌细胞远处转移的过程中起着重要的调控作用。胎盘滋养细胞类似于肿瘤细胞，也具有迁移及侵袭等特征，而其侵袭性主要依赖于大量的蛋白水解酶（如:MMP-2、MMP-9等）及细胞粘附分子（如E-cadherin）等，共同参与细胞外基质的降解而得以实现的。那么AP-2仅是否也能通过调控滋养细胞中MMP-9及E-cadherin的表达，而影响滋养细胞的侵袭力，从而可能参与子痫前期的发病呢？对这一观点的提出，目前国内外尚未见报道。越来越多的关于COPD和人乳腺癌等的研究发现，AP-2α能通过调节VEGF、P53、p21WAF/CIP、Bcl-2和MnSOD等的表达，进而参与调控细胞凋亡过程。多项研究也发现，Bcl-2和Bax异常表达与子痫前期中滋养细胞发生过度凋亡有关，那么滋养细胞中Bax和Bcl-2是否也受到AP-2α的直接转录性调控，从而诱导滋养细胞发生过度凋亡，对这一观点的提出，目前国内外也未见报道。　　 本研究采用免疫组化及realtime-PCR的方法检测AP-2α与Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在重度子痫前期胎盘组织中的表达，进而通过体外培养人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，分别瞬时转染及干扰BeWo细胞中AP-2α的表达，采用realtime-PCR及Westernblot的方法，从基因及蛋白水平分别检测AP-2α下游靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin表达的变化;同时分别采用MTT方法、Transwell方法及FCM方法检测AP-2α对BeWo细胞增殖、侵袭及凋亡作用的影响，进一步分析AP-2α是否通过直接转录性调控Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表达，而影响滋养细胞的凋亡及侵袭力等生物学功能，从而说明AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在重度子痫前期的发病机制中共同发挥重要的作用。　　 第一部分:AP-2α及相关靶基因在重度子痫前期胎盘组织中的表达　　 目的：　　 本研究通过分析AP-2α及靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在重度子痫前期组胎盘组织与正常对照组胎盘组织中的定位和表达的变化，探讨AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin在子痫前期发病机制中可能发挥的作用。　　 方法：　　 采用免疫组化的方法，检测重度子痫前期组胎盘组织及正常对照组胎盘组织中，AP-2α及其靶基因E-cadherin、MMP-9、Bax和Bcl-2的定位及蛋白的相对表达;采用realtime-PCR方法，检测重度子痫前期组胎盘组织及正常对照组胎盘组织中AP-2α及Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherinmRNA的相对表达。　　 结果：　　 1.免疫组化结果分析:　　 (1)AP-2α、Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin蛋白在胎盘组织中，均表达于胎盘滋养细胞及绒毛外滋养细胞，其中AP-2α主要表达于细胞核，E-cadherin主要表达于细胞膜，MMP-9、Bax和Bcl-2主要表达于细胞膜及细胞浆。　　 (2)重度子痫前期组胎盘组织中，AP-2α、Bax及E-cadherin的阳性表达明显高于正常对照组(P＜0.05);而Bcl-2和MMP-9在重度子痫前期组胎盘组织中的阳性表达明显低于正常对照组(P＜0.05)。　　 2.realtime-PCR结果分析:　　 重度子痫前期组胎盘组织中AP-2α、Bax和E-cadherinmRNA的相对表达量均明显高于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05);而在重度子痫前期组胎盘组织中Bcl-2和MMP-9mRNA的相对表达量明显低于正常对照组，差异有统计学意义(P＜0.05)。　　 结论　　 AP-2α及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin可能共同参与子痫前期的病理过程。　　 第二部分:AP-2α对滋养细胞侵袭、增殖及凋亡作用的研究　　 目的：　　 Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin均为转录因子AP-2α的下游调控靶基因，根据第一部分研究结果提示:重度子痫前期胎盘组织中AP-2α、E-cadherin和Bax的表达异常增高，MMP-9及Bcl-2的表达异常降低。因此，本部分研究我们意在进一步探讨，AP-2α是否通过直接转录性调控胎盘组织中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin的表达，影响滋养细胞生物学行为，从而诱导子痫前期的发生及发展，同时也进一步说明AP-2α在子痫前期的发病中可能起着重要的调节作用，为今后治疗子痫前期提供新的理论依据。　　 方法：　　 体外培养人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞，（BeWo细胞可替代正常胎盘滋养细胞，作为滋养细胞分化、侵袭及凋亡等生物学功能研究的模型），构建AP-2α真核表达载体，分别采用AP-2α表达载体和AP-2αsiRNA瞬时转染BeWo细胞，通过realtime-PCR及Westernblot方法分别检测BeWo细胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherinmRNA及蛋白的表达;采用MTT的方法检测AP-2α是否影响BeWo细胞的增殖;通过Transwell小室检测AP-2α是否影响BeWo细胞的侵袭行为，以及采用流式细胞术检测AP-2α是否促进BeWo细胞凋亡。　　 结果：　　 1.构建人AP-2α基因真核表达载体　　 经测序鉴定，pIRES2-EGFP/AP-2α真核表达载体构建成功。　　 2.AP-2α质粒及AP-2αsiRNA瞬时转染采用pIRES2-EGFP/AP-2α质粒DNA转染BeWo细胞48h，realtime-PCR检测结果显示:与空质粒细胞组及空白细胞组对比，BeWoAP-2α细胞组中AP-2αmRNA的表达显著增高;采用Westernblot方法检测转染48h三组BeWo细胞中AP-2α的蛋白表达，统计学分析结果显示:与空质粒细胞组及空白细胞组对比，BeWoAP-2α细胞组中AP-2α的蛋白表达显著增加，故以pIRES2-EGFP/AP-2α真核表达质粒转染BeWo细胞48h，作为后续实验的检测时间点。采用3个AP-2αsiRNA片段分别转染BeWo细胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分别检测AP-2α的基因及蛋白的表达，经统计学分析结果显示:与空白细胞组相比，BeWoAP-2αsiRNA1组中AP-2αmRNA及蛋白的表达降低最为显著(P＜0.05)，故以转染BeWo细胞96h，AP-2αsiRNA1片段作为后续实验的干扰片段。　　 3.AP-2α对BeWo细胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白表达的影响　　 AP-2α基因真核表达载体转染BeWo细胞48h，realtime-PCR及Westernblot方法分别检测BeWo细胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表达，统计学分析结果显示:与空白细胞组及空质粒细胞组对比，BeWoAP-2α细胞组中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表达明显增强，而Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表达明显降低。AP-2αsiRNA1转染BeWo细胞96h，realtime-PCR及Westernblot方法分别检测BeWo细胞中Bax、Bcl-2、MMP-9和E-cadherin基因及蛋白的表达，统计学分析结果显示:与空白细胞组对比，BeWoAP-2αsiRNA1组中Bax及E-cadherinmRNA及蛋白的表达明显降低，而Bcl-2及MMP-9mRNA及蛋白的表达明显增高(P＜0.05)。　　 4.AP-2α对BeWo细胞增殖、侵袭及凋亡行为的影响　　 AP-2α基因真核表达载体转染BeWo细胞后，采用MTT方法检测BeWo细胞增殖率，结果显示:转染AP-2α质粒细胞组与空质粒细胞组及空白细胞组对比，无显著性差异;经Transwell小室对BeWo细胞侵袭细胞数量的检测统计学分析，结果显示:转染AP-2α质粒细胞组与空质粒细胞组及空白细胞组对比，细胞侵袭的数量显著减少。　　 AP-2α基因真核表达载体转染BeWo细胞后，经流式细胞仪方法检测细胞凋亡率，统计学分析结果显示:与空质粒细胞组及空白细胞组对比，转染AP-2α质粒细胞组中细胞凋亡率显著增加(P＜0.05)。AP-2αsiRNA1转染BeWo细胞后，与空白细胞组对比，BeWo细胞凋亡率则显著降低(P＜0.05)。　　 结论：　　 1.构建pIRES2-EGFP/AP-2α真核表达载体，并成功转染人绒毛膜癌滋养细胞株BeWo细胞;　　 2.体外研究进一步证实，AP-2α通过转录性调节滋养细胞中E-cadherin和MMP-9的表达，起到抑制滋养细胞侵袭力的作用，为进一步阐明滋养细胞侵入不足与子痫前期发病的关系，提供了参考的理论依据。　　 3.体外研究进一步证实，AP-2α通过转录性调节滋养细胞中Bax和Bcl-2的表达，起到促进滋养细胞凋亡的作用，为进一步阐明滋养细胞过度凋亡与子痫前期发病的关系，提供了可靠依据，同时也为子痫前期发病机制的研究提供一个新的研究方向。