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第一部分ANXA2单核苷酸多态性(SNPs)与乳腺癌发病机制的研究目的:通过PCR-SSCP及双向测序检测人体乳腺癌组织中ANXA2基因单核甘酸多态性(SNPs),探讨其与乳腺癌发病机制的关系。方法:收集川北医学院附属医院2015年4月至2015年6月新鲜人体乳腺癌组织及癌旁正常组织标本14例,及时提取总RNA并逆转录成cDNA;通过NCBI以及primer3.0 input等网站构建ANXA2的5条引物,使之能最大限度的包含整个ANXA2基因的编码区。首先使用半定量RT-PCR对目的基因ANXA2进行扩增,用非变性PAGE凝胶电泳法对PCR产物进行分离,即PCR-SSCP分析人体乳腺癌组织中ANXA2突变情况;其次通过双向测序法对PCR产物中ANXA2基因进行测序,再次将所得碱基序列与NCBI等数据库的序列进行比对,从而发现突变的碱基以及氨基酸的改变,进而分析突变位点与乳腺癌的关系。结果:在14例人体乳腺癌组织及癌旁正常组织中,PCR-SSCP检测未发现明显的基因突变条带;双向测序结果比对发现,ANXA2基因在癌组织组中有21个碱基突变位点共53个氨基酸改变,在癌旁正常组织中有9个碱基突变位点共23个氨基酸改变。其中仅在癌组织有突变的位点有:1071位点G/C突变6例,突变率42.86%(P=0.023);531位点突变7例(A/T 2例,A/G 5例),突变率50%(P=0.006);260-261位点GA/TG突变5例,突变率35.71%(P=0.041)。这三个位点的突变暂未见报道,是新的突变位点,其可能与乳腺癌的发生发展有关。380位点G/T突变同时出现在癌旁正常组织中(6例,突变率42.86%)和癌组织中(2例,突变率14.29%),可能是因为样本量不足,二者差异无统计学意义(P>0.05)。结论:乳腺癌组织ANXA2基因中存在稳定的碱基突变,包括1071位点的G/C突变、531位点的A/T与A/G突变和260-261位点的GA/TG突变,它们可能与乳腺癌的发生发展有密切的关系。第二部分RNAi阻低UBE3A后对ANXA2在乳腺癌亚细胞定位的影响目的:通过sh RNA阻低UBE3A基因的表达后,检测ANXA2在乳腺癌亚细胞中的定位,以探讨UBE3A调节ANXA2的功能,从而影响乳腺癌细胞浸袭能力的机制。方法:将课题组已筛选出来的最有效UBE3A-sh RNA慢病毒载体转染至MDA-MB-231细胞中,使用RT-PCR及WB验证UBE3A的阻低效率,然后使用激光扫描共聚焦检测ANXA2在乳腺癌亚细胞分布。结果采用SPSS19.0进行统计分析,当P<0.05为差异有统计学意义。结果:细胞成功转染慢病毒,96小时后阴性对照组和实验组的转染率分别为100%和95%以上。空白组UBE3A基因和蛋白质表达水平(0.59±0.029,0.35±0.017)与阴性对照组UBE3A基因和蛋白质表达水平(0.65±0.042,0.46±0.023)相比其差异在统计学上均无意义(P>0.05);实验组中的UBE3E基因和蛋白质的表达水平分别为(0.29±0.036,0.16±0.015)与空白组的基因和蛋白质表达水平相比均降低,抑制率分别为(50.8%,48.4%),且差异均有统计学意义(P=0.000),说明UBE3A基因被有效阻低。激光扫描共聚焦显微镜结果显示:在空白组和阴性对照组中,ANXA2主要分布在细胞膜;在实验组中则主要分布在细胞质中,且其差异有统计学意义(P=0.001),结果提示ANXA2亚细胞定位随着UBE3A的阻低而改变。结论:UBE3A阻低后,介导ANXA2到细胞膜的相关通路(UBE3A/p53/ANXA2/EGFR)功能发生改变,UBE3A可能通过影响ANXA2的亚细胞定位从而影响乳腺癌细胞的浸袭能力。结果表明UBE3A与ANXA2在功能上密切相关,它们在乳腺癌的发生发展中可能扮演着重要角色。