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研究目的:分选蛋白家族(SNXs)是含有SNX-PX结构域(磷酸盐同源结构域家族的一个亚型)的一类外周蛋白。作为Retromer复合体的一部分,SNXs协助Retromer复合体将物质从内膜系统转运到高尔基体,因此SNXs家族就与膜内物质转运及分解相关。作为SNXs家族重要一员的SNX5在甲状腺乳头状癌中高表达,而在肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌及卵巢癌中低表达。提示SNX5可能在恶性肿瘤的发生发展中发挥作用。本研究主要探讨SNX5表达量与乳腺癌细胞增殖的关系,并进一步探讨SNX5表达量与细胞增殖调控之间的联系,初步阐明SNX5在细胞周期通路中可能发挥的作用。研究内容:分析SNX5在肿瘤组织标本中的细胞定位情况;SNX5真核表达载体的构建;构建SNX5高表达肿瘤细胞系;运用小干扰RNA构建SNX5沉默肿瘤细胞系;流式细胞仪检测过表达及沉默SNX5后细胞周期的变化;阐明周期相关基因与SNX5的关系。研究方法:本研究首先通过基于基因表达谱的乳腺癌预后在线预测网站(Gene expression-based outcome for breast cancer Online,GOBO)预测SNX5表达量与乳腺癌患者预后的关系,然后应用免疫组织化学技术将肿瘤组织标本中SNX5蛋白染色,通过细胞显微镜观察其在胞浆、胞核中的着色情况。进而,我们通过体外实验研究SNX5的具体作用机制,运用PCR技术扩增目的基因SNX5。并通过与真核表达载体连接,构建SNX5真核表达载体。表达质粒利用非脂质体Fu GENE?HD Transfection Reagent介导转染SNX5过表达质粒,即构建SNX5高表达肿瘤细胞株。我们购买了SNX5小干扰RNA,并且通过转染构建了SNX5沉默的细胞株。应用CCK-8法、平板克隆、及EDU检测SNX5与细胞增殖之间的关系,并应用流式细胞仪观察SNX5对细胞周期的影响。通过Double-Thymidine法,将细胞同步于G1/S期,通过流式细胞仪和Western Blot方法研究细胞周期分布和细胞周期检测点蛋白表达变化。最后,应用细胞周期相关基因检测试剂盒检测SNX5基因与周期相关基因之间的关系。通过我们的研究第一次探讨了SNX5与乳腺癌细胞增殖的关系,研究SNX5在调控细胞周期进程中所发挥的作用,并且初步探讨了SNX5与细胞周期相关基因之间的关系。研究结果:我们发现,SNX5蛋白在癌组织中高表达,在癌周组织中低表达。在MCF-7与MDA-MB-231乳腺癌细胞系中,应用si RNA沉默SNX5后,细胞增殖受到明显的抑制,而在MCF-7中高表达SNX5后,细胞增殖明显增多,说明SNX5促进乳腺癌细胞增殖。在MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌细胞系中,沉默SNX5后促使癌细胞阻滞在G1/S期,而过表达SNX5后会促进细胞进入S期,说明SNX5与细胞周期相关。为了进一步证实SNX5通过双胸苷法阻滞Hela细胞于G1/S期释放,流式细胞术显示沉默SNX5表达后,证实癌细胞阻滞在G2/M期。细胞周期相关基因试剂盒检测显示,沉默SNX5表达后,P15、P16、CDK1基因表达量上升,提示P15及P16基因在沉默SNX5表达后,可能与癌细胞阻滞相关。研究结论:SNX5与乳腺癌的增殖密切相关,并且可能通过影响细胞周期来控制癌细胞的增殖。