癌症是严重威胁人类健康和社会发展的重大疾病,是致人死亡的主要原因之一,其发病率呈现逐年上升的趋势。癌症的早期诊断与预后监测是提高癌症患者治愈率和生存率的关键,已成为全球科学界重点关注的科学问题之一。传统的诊疗技术通常因为非特异性相互作用力的存在,可能在诊断过程中出现假阳性而导致误诊。近年来,随着纳米技术的发展及其与生物医学的不断融合,为开发新型肿瘤成像技术提供了基础。与此同时,一些具有特殊功能或结构的核酸分子,如核酸适配体(Aptamer)、DNA双链、DNA三链、DNA四聚体等,为成像探针的靶向识别和信号激活提供了新的手段。本论文正是基于上述研究背景,围绕如何提高肿瘤细胞成像中的靶向性、信背比和灵敏度,利用碳纳米管和I-motif结构开展了一系列aptamer靶向激活式荧光探针构建及其肿瘤成像应用研究工作。具体包括以下几方面的内容:一、基于碳纳米管高效荧光淬灭和DNA吸附性能的激活式核酸适配体探针构建与肿瘤靶向成像研究利用单壁碳纳米管(SWNT)对DNA分子的吸附性能及其对邻近荧光分子的高效淬灭作用,选择基于cell-SELEX技术针对CCRF-CEM人急性白血病细胞筛选的特异性Aptamer Sgc8c作为模型,成功构建了一种Aptamer-碳纳米管复合体的激活式肿瘤成像探针(F-apt/S WNT)。在正常情况下,F-apt通过在S WNT表面的自组装作用,形成稳定F-apt/S WNT复合物。由于染料与S WNT之间的共振能量转移作用,此时染料荧光处于淬灭状态。当有靶标存在时,Aptamers与靶标上面的受体结合,从而使F-apt远离SWNT,荧光得以恢复,实现肿瘤细胞的激活式荧光成像。无论在缓冲液中还是小鼠移植瘤模型内,该探针均有很好的靶向性。通过与“alwayson”探针对比证实,SWNT可有效降低体系中未结合探针的非特异性信号背景干扰,从而明显改善靶肿瘤细胞的体外分析信背比和活体成像对比度。这一探针设计简单、操作方便,有望发展成为一种低背景、高对比、高特异且具有普遍适用性的肿瘤成像方法。二、基于Ⅰ-motif构型转化的pH响应激活式核酸适配体探针构建与肿瘤靶向成像研究DNA除了大家熟知的双螺旋结构外,它还存在多种结构,如:发夹结构、三链DNA、Ⅰ-motif、G-quadruplex、十字架DNA等,利用这些独特的结构可巧妙地设计多种DNA纳米探针。针对肿瘤生成、发展过程中产生的酸性微环境,本章利用在微酸性条件下形成Ⅰ-motif结构的富C序列结合Aptamer设计了具有pH响应的激活式肿瘤成像探针(Ⅰ-AAP)。这个探针包含两条序列,其中一条为罗丹明染料标记的序列(含识别靶向细胞的Aptamer部分和与富C链杂交的延长部分),另一条标有淬灭基团BHQ2的富C链为Ⅰ-motif形成序列。在中性或弱碱性条件下,富C链与罗丹明染料标记序列中的延长部分杂交形成稳定的双链,罗丹明染料与富C链的BHQ2基团靠近,其荧光处于淬灭状态。而当Ⅰ-AAP探针处于微酸性环境下,富C链发生构型转化形成Ⅰ-motif结构,导致荧光染料与淬灭基团分离,从而实现荧光信号的激活,通过Aptamer的靶向作用实现对细胞的成像。MCF-7细胞的核酸适配体AS1411被选作模式分子,通过体外模拟实验以及离体肿瘤组织考察表明,该方法能有效降低检测体系中的背景信号干扰,并实现了MCF-7肿瘤细胞的特异检测和成像。这一探针设计方法为发展高灵敏的激活式探针用于肿瘤细胞的实时原位成像提供了新思路。三、肿瘤酸性微环境响应的高pH敏感Ⅰ-motif序列筛选研究在上一章工作中,我们选用最经典也是研究最多的人类端粒富C序列(12C-TA),成功设计了 pH响应的Ⅰ-AAP探针,并能在体外模拟微酸环境和离体肿瘤组织中实现信号激活。由于该探针中的Ⅰ-motif结构需要在低温(4℃)下形成,因而无法直接用于活体成像。为了克服现有Ⅰ-motif结构的缺陷,如低温依赖性形成及低的pH转换点,我们通过设计一系列富C序列,系统地考察富C链与Ⅰ-motif形成之间的关系。通过增加富C链中C碱基的数目以及改变连接环种类,一系列不同的富C链被用于考查Ⅰ-motif结构的形成筛选,采用紫外吸收和荧光分析方法来表征Ⅰ-motif结构的形成与否。主要针对生理温度和肿瘤微酸环境,分析富C序列在37 ℃、pH 6.5条件下形成Ⅰ-motif结构的能力大小,了解其规律以便用于后续实验设计。四、基于靶细胞识别诱导构型变化与Ⅰ-motif构型转化的双响应激活式核酸适配体探针构建与肿瘤靶向成像研究Aptamer能对靶标进行特异性识别,并且具有序列设计灵活以及肿瘤相关靶标可触发Aptamer探针构型变化的特点。结合上个工作中对Ⅰ-motif组成序列的规律考察及筛选的高pH敏感的Ⅰ-motif序列,我们巧妙地设计了一种能够对靶细胞特异性识别与肿瘤酸性微环境双响应的激活式核酸适配体探针用于肿瘤成像研究。在弱碱性条件下(pH=7.4),Aptamer序列与富C序列杂交形成稳定的双链,Aptamer标记的荧光染料与富C链标记的淬灭基团靠近,荧光处于淬灭状态。当靶细胞存在时,探针中Aptamer序列与靶细胞发生特异识别诱导构型变化,可实现弱的信号激活,如果同时,探针处于酸性微环境下(pH=6.5),由于富C链能发生构型转化形成Ⅰ-motif结构,会促进Aptamer链的进一步释放,有利于其与靶细胞的识别结合。在两者的共同作用下,从而实现荧光信号的高效激活。