一、研究背景及目的随着生活水平的提高和饮食习惯的改变,以非酒精性脂肪肝(NAFLD)、冠心病等为表现的代谢综合征发病率呈现逐年升高的趋势[1],西方主要国家NAFLD一般人群患病率在20%~30%[2],我国部分地区体检发现其患病率为15.5%~33.9%[3]。近年来的基础和临床研究发现,NAFLD和冠心病不仅因为危险因素相似[4],而作为代谢综合征的两个表现,前者还很可能通过分泌炎症因子、影响血脂代谢、参与胰岛素抵抗等方式作为独立的临床危险因素参与到了冠心病的发生和发展中[2,5-8]。不仅如此NAFLD还和房颤、QT间期延长等相关[7,9-12]。因此,对于NAFLD的防治的研究,不仅有助于NAFLD患者的治疗、改善异常的血脂代谢和纠正胰岛素抵抗,同时还有利于减少冠心病和其他心血管病的发生,为心血管病的防治提供新的思路。CGI-58(Comparative Gene Indentification-58),也称为Abhd5,是α/β水解酶折叠蛋白家族的第五个成员[13];它在体内各个组织中广泛表达,也包括人和小鼠的肝脏细胞。在人类,CGI-58突变会引发Chanarin-Dorfman综合征[14]。虽然CGI-58本身并不具有甘油三酯(Triglyceride,TG)水解酶活性,但它作为激活因子在体外能激活甘油三酯水解的限速酶ATGL(Adipose triglyceride lipase)[14,15],进而促进甘油三酯水解。肝脏特异性敲除CGI-58的小鼠(Liv KO),普食喂养42周即可出现显著的肝纤维化,并且整个病程会出现从肝细胞脂滴聚集、肝纤维化到肝硬化的系列改变[16,17],与NAFLD的病理过程极为相似,能够很好模拟整个疾病过程。通过蛋白组学对肝脏样品的检测分析,我们发现Perilipin 2(Plin2)在Liv KO的小鼠中高表达,提示Plin2可能参与了NAFLD的发生和发展。Plin2是PAT蛋白家族成员,该蛋白家族主要负责包被脂滴,目前已发现的有5个成员,即Perilipin1(Plin1)、Plin2、Perilipin3(Plin3)、Perilipin4(Plin4)和Perilipin5(Plin5)[18,19]。各个成员在组织中的表达有明显差异,肝脏以Plin2、Plin3和Plin5表达为主,其中Plin2表达水平最高[20]。肝脏特异性敲除Plin2后能够减轻由蛋氨酸胆碱缺乏饲料引起的肝脂肪变性和纤维化[21]。高脂饲料喂养下,C57小鼠在寡意核苷酸干扰Plin2后,表现出肝脏TG降低,肝胰岛素敏感性增加[22-24]。在Leptinob/ob小鼠模型上,肝脏特异性敲除Plin2后,除能减轻高脂饲料喂养下的肝脏脂肪变性外,还能够改善全身的胰岛素抵抗[25]。这些都提示Plin2可能是治疗NAFLD的潜在靶点。然而Liv KO小鼠上抑制Plin2的表达是否能够缓解肝脂肪变性、减轻纤维化目前仍不清楚,其对血脂的影响也有待证实。此外之前的研究用饲料与人群实际差距较大,未考虑高胆固醇的因素,因此有必要在Liv KO小鼠上抑制肝脏Plin2的表达,观察其在高脂高胆固醇长期饲养下的血脂变化及肝脏改变,探讨Plin2引起改变的机制,为治疗NAFLD、改善血脂异常以及治疗CGI-58变异导致的疾病提供研究基础。二、研究内容及方法1、在Liv KO小鼠模型基础上筛选可能用于治疗NAFLD和治疗CGI-58变异导致的疾病的蛋白。1.1选取雄性8周龄Western Diet喂养3周的Liv KO及对照小鼠,收取肝脏组织,处理后送蛋白质组学iTRAQ检测1.2根据iTRAQ检测结果,结合生物信息学分析,找到目标蛋白,Western Blot验证蛋白质组学结果。2、在Huh7细胞系上进一步验证目标蛋白敲除后的效果,同时也为后续机制研究提供细胞平台。2.1采用Crispr-cas9[26]基因编辑技术敲除CGI-58,并在此基础上进一步敲除Plin2和单独敲除Plin2,挑选单克隆细胞,用T7E1酶切分析、Western Blot以及测序鉴定确认基因敲除效果。2.2按照基因编辑情况分为4组,即:WT组、Plin2 KO组、CGI-58 KO组和CGI-58/Plin2 KO组,进行提脂后检测甘油三脂和胆固醇变化。2.3荧光染色观察细胞脂滴变化,将4组细胞用BODIPY对脂滴进行染色后,荧光显微镜观察其改变。3、在Liv KO小鼠模型上,采用AAV介导的sh RNA干扰肝脏Plin2 m RNA表达后观察肝脏形态学改变、脂质改变、血生化改变、糖代谢变化以及对纤维化的影响,探讨可能的机制。3.1将6周龄的小鼠分为4组分别Control(AAV-)、Control(AAV+)、KO(AAV-)、KO(AAV+),每组6只,雌雄均按照此法分类,对将标记为AAV+的组注射带有sh RNA的干扰病毒,对标记为AAV-的组注射对照病毒,Western Diet喂养14周。3.2每周测量体重变化。于喂养11周时测量进食量。于喂养2周和12周测量体脂比例。于喂养3周和12周行GTT、ITT测试。于喂养13周时测量PTT。3.3喂养14周后处死小鼠,收集标本。Western Blot和Q-PCR检测Plin2的干扰效率。Western Blot检测CGI-58验证基因型。3.4肝脏提脂测量TG、TC、FC、CE、PL改变。测量血液TG、TC、FC、CE、PL、ALT、AST改变。3.5 HE染色观察肝脏形态变化,Picro-Sirius Red染色观察肝脏纤维化程度的改变。3.6 Western Blot检测Plin1、Plin3、Plin4、ATGL、HSL、MTTP的蛋白表达改变。Q-PCR检测Plin1、Plin3、Plin4、Plin5、ATGL的改变。3.7 Q-PCR检测Procollagen、Col.a1、a-SMA、TGF-β改变。三、研究结果1、蛋白质组学检测及Western Blot检测iTRAQ共检测出3404个蛋白,其中3020个可信蛋白。发现Plin2在Liv KO小鼠肝脏中的表达量为高表达。与对照组相比有显著性差异的上调蛋白131个、下调蛋白51个,其中Plin2上调1.67倍(P<0.01),Western Blot在Western Diet和普食喂养均检测确认了上述变化。2、基因敲除细胞验证Plin2敲除效果2.1通过测序验证了基因敲除细胞在Crispr-cas9可能编辑的位置产生了点突变,同时Western Blot证实CGI-58和Plin2目标条带消失。2.2细胞TG测量,WT组、Plin2 KO组、CGI-58 KO组和CGI-58/Plin2 KO组浓度分别为WT为49.77±2.67ug/mg protein、38.76±3.82ug/mg protein、176.31±7.52ug/mg protein和110.78±6.49ug/mg protein,各组之间两两均存在显著性差异2.3细胞TC测量,WT组、Plin2 KO组、CGI-58 KO组和CGI-58/Plin2 KO组浓度分别为32.97±1.75ug/mg protein、40.58±3.95ug/mg protein、53.20±3.44ug/mg protein和56.90±3.58ug/mg protein,WT组和CGI-58 KO组、Plin2 KO组和CGI-58/Plin2KO组两两存在显著性差异(P<0.01)。2.4荧光显微镜观察细胞脂滴染色存在差异。3、Plin2敲低对Liv KO小鼠形态学改变、脂质改变、血生化改变、糖代谢变化以及对纤维化的影响3.1 AAV干扰后降低了小鼠68.18%-72.52%的m RNA表达,52.15%-67.45%的Plin2的蛋白表达,且均有统计学差异3.2雄性小鼠Control(AAV-)、Control(AAV+)、KO(AAV-)和KO(AAV+)肝重分别为1.89±0.18g、1.66±0.15g、3.34±0.27g、2.95±0.22g,雌性小鼠对应4组为1.71±0.14g、1.60±0.16g、3.14±0.26g、2.75±0.36g,无论雌雄,Control(AAV-)与KO(AAV-)、Control(AAV+)与KO(AAV+)存在显著差异(P<0.01)。3.3无论小鼠性别,各组体重在各个测量时间点上无显著差异,体脂比例在Western Diet饲养2周和12周时无显著差异,进食量仅存在性别差异,雄性为2.95±0.06g,雌性为2.63±0.06g。3.4雄性小鼠GTT和ITT在3周时各组无差异,12周时GTT、ITT、PTT 16h和6h均出现差异,差异主要出现在Control(AAV-)与KO(AAV-)和Control(AAV+)与KO(AAV+),雌性小鼠均无差异。3.5雄性小鼠Control(AAV-)、Control(AAV+)、KO(AAV-)和KO(AAV+)肝脏TG分别为1257.53±187.19ug/mg protein、903.64±218.24ug/mg protein、3871.94±325.52ug/mg protein、2882.21±276.56ug/mg protein,雌性小鼠对应为1187.15±231.68ug/mg protein、959.73±159.00ug/mg protein、3450.44±266.75ug/mg protein、2543.39±270.70ug/mg protein。无论性别,Control(AAV-)与KO(AAV-)(P<0.01)和KO(AAV-)与KO(AAV+)(P<0.05)存在显著性差异。TC、FC、CE、PL的显著性差异差异主要出现在Control(AAV-)与KO(AAV-)和Control(AAV+)与KO(AAV+)间。3.6无论小鼠性别,各组血液中的TG、TC、FC、CE、PL没有出现显著性变化。3.7无论小鼠性别,ALT和AST在Control(AAV-)与KO(AAV-)(P<0.01)和KO(AAV-)与KO(AAV+)(P<0.01)间存在显著性差异。3.8无论小鼠性别,Plin1、Plin3、Plin4的蛋白的表达在Control(AAV-)与Control(AAV+)和KO(AAV-)与KO(AAV+)间无差异,Plin3的蛋白表达和m RNA表达水平在Control(AAV-)与KO(AAV-)间存在显著性差异(P<0.05)。Plin5的m RNA表达在各组间无差异。3.9 HE染色显示KO(AAV-)和KO(AAV+)组脂滴聚集明显,且KO(AAV+)较KO(AAV-)脂滴减少。Picro-Sirius red染色显示KO(AAV-)和KO(AAV+)组出现了纤维化,KO(AAV+)较KO(AAV-)纤维化明显减少。3.10雄性小鼠Procollagen、Col.a1、a-SMA、TGF-β的m RNA表达存在显著性差异,KO(AAV-)与Control(AAV-)相比表达分别增加了12.58、15.47、6.99、2.84倍(P<0.01),KO(AAV+)和KO(AAV-)相比表达分别下降了66.63%、58.56%、47.78、50.89%(P<0.01)。四、结论1、小鼠肝细胞敲除CGI-58基因能够导致Plin2蛋白表达增高。2、无论是否敲除CGI-58基因,Plin2敲除均能有效降低Huh7细胞内的甘油三酯水平,可能与Plin2敲除后脂滴形成减少有关。3、敲低Plin2能够有效降低CGI-58基因敲除后肝脏的甘油三脂水平,减少高脂高胆固醇饮食诱发的CGI-58基因敲除后的肝损伤和纤维化,与敲低后纤维化因子表达降低有关,有望成为防治的新靶点。4、结合文献结果[22,23],Plin2敲低没有对血甘油三脂、总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂、磷脂造成显著影响,对于糖代谢、体重、体脂比也无显著影响。提示其作为防治靶点具有安全性。5、Liv KO小鼠模型上,Western Diet饲养能够更早模拟出肝纤维化的表型,有利于相关研究的开展。同时也提示高脂高胆固醇饮食对CGI-58变异导致疾病的患者有更大伤害。