研究背景:调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)是T细胞的一个亚群。除了表达CD4分子外,Treg还构成性表达CD25(IL-2受体α链)和转录因子Foxp3。Foxp3是维持Treg发育和功能的重要转录因子。Foxp3+Treg包括:自然调节性T细胞(nTreg),由胸腺发育分化而来;诱导型调节性T细胞(iTreg),由体外诱导而来。Treg区别于CD4+常规T细胞(Tcon)另一特征是因为Treg低表达或不表达CD127(即IL-7Rα)。Treg能够抑制Tcon活化和增殖,在免疫稳态调控方面发挥着重要作用,参与对自身免疫、慢性炎症及移植免疫等的调控,Treg的缺失或数量减少将发生严重的自身免疫性疾病。因此,调节性T细胞在免疫调节治疗中有着重要意义。目前,同种异体肾移植作为慢性肾病终末期的有效治疗手段,为抑制移植排斥需要长期使用免疫抑制剂,虽然明显降低了急性排斥反应的发生率,提高了肾移植的成功率,但慢性排斥反应及免疫抑制剂所带来的副作用仍是影响人肾存活的主要因素,因此为了实现移植免疫耐受成为移植领域的最高追求。虽然近年有报道已经建立起有效的防止移植排斥反应的实验模型;以及在造血干细胞移植领域,调节性T细胞已经用于抑制移植物抗宿主病(GVHD)的治疗。但是,由于nTreg的细胞数量极少以及nTreg在体内稳态增殖的机制不清和iTreg功能、表型不稳定等问题限制了临床的广泛使用。因此,为了防止移植排斥反应,研究nTreg稳态增殖的机制就显得尤为重要。白介素-7(IL-7)是一种造血生长因子,在维持T细胞稳态中有着重要地位及意义。IL-7的信号通路主要依赖于IL-7受体,该受体由α和γ链形成的二聚体组成。因为γ链在淋巴细胞上普遍表达,故IL-7的应答主要受控于IL-7Rα,属于其特异性受体。IL-7Rα(CD127)表达水平的调控是活化Tcon细胞维持其稳态增殖的关键机制。既往认为,由于IL-7Rα在nTreg持续低表达,故认为其对nTreg增殖无明显作用,现采用基因敲除技术证实,IL-7Rα的敲除可严重干扰外周n Treg的稳态增殖,提示IL-7Rα同样是nTreg增殖的重要调控因素。因此,IL-7Rα在T细胞稳态中也起着关键作用。然而,IL-7Rα如何控制nTreg的增殖和代谢的分子机制仍不清楚。Foxo1是一种转录因子,可以通过其单体与同源的DNA位点结合发挥其调控作用。研究表明,小鼠在敲除Foxo1基因后会出现一种致命的炎症性疾病。事实上,越来越多的研究证实,Foxo1在免疫系统中发挥重要作用,包括外周T细胞稳态。Foxo1作为Foxo家族一员,Foxo的活性受其亚细胞定位影响,而其亚细胞定位又受Foxo的磷酸化水平影响。Foxo1能够调控Tcon细胞IL-7Rα的表达,Foxo1可与一个进化上高度保守的Foxo1结合位点结合,促进Il7r的转录和IL-7Rα的表达;而当T细胞受抗原刺激活化后可通过TCR、CD28和IL-2等细胞因子(包括IL-7)活化PI3K-Akt信号通路。Akt激活后导致Foxo1磷酸化形成p-Foxo1,降低了Foxo1与DNA的结合能力,因此p-Foxo1则由细胞核内转入胞浆,在胞浆中与14-3-3蛋白相互作为形成复合物而潴留于胞浆,阻断其对Il7r基因的转录活性,导致IL-7Rα的表达下调。然而,Treg却天然的存在Akt磷酸化障碍或者低下,而且这一特性是Treg细胞维持功能稳定所必需,这是与Tcon细胞最显著的区别。因此Foxo1是如何参与调控nTreg细胞稳态的胞内机制仍然不清楚。鉴于Treg在自身免疫调控、移植免疫、肿瘤免疫等诸多领域的重要作用,其被调控增殖活化、凋亡信号机制的揭示属于当务之急。在Tcon细胞稳态增殖的研究中,Foxo1、IL-7可以通过影响抗凋亡基因Bcl2参与对Tcon凋亡的调控,而Foxo1、IL-7对Treg细胞凋亡的调控机制是否也是通过Bcl2需要进一步验证。同时,研究发现转录因子Foxo1能够影响抗凋亡基因Aven表达,Aven是一种与抗凋亡蛋白相关的衔接蛋白,具有抗凋亡和DNA损伤修复功能,在恶性肿瘤发生、转移、化疗耐药中发挥重要作用,Aven是否在Treg细胞凋亡中扮演着重要角色并不清楚。因此,我们推测并尝试验证Foxo1可能可以通过IL-7Rα和Aven调控Treg稳态和功能。目的:通过质粒转染和siRNA干扰等技术干预Foxo1和Aven在nTreg中的表达,观察转录因子Foxo1是如何通过影响CD127和Aven的表达参与调控nTreg增殖与凋亡。方法:1.n Treg细胞的流式分选从Foxp3-GFP(购自美国Jakson实验室,Foxp3最后一个外显子插入GFP,不影响Treg细胞功能)小鼠分离脾淋巴细胞。取6-8周Foxp3-GFP小鼠,麻醉方式是通过腹腔内注射,麻醉药品是4.5mg/kg的戊巴比妥钠注射液,麻醉后将小鼠放置于无菌操作台上(实验前,紫外灯照射30分钟),小鼠昏迷之后脱颈处死,75%酒精中擦拭全身,用眼科剪打开左侧腹腔,取出脾脏,用含200万单位青霉素、链霉素双抗的1640培养基漂洗,而后置于无菌的200目的细胞筛上,在小鼠脾脏上滴加1毫升含5%胎牛血清的1640培养基,将脾脏剪成碎片,用消毒后玻璃棒轻轻按压,将脾脏挤碎,促使脾脏中的免疫细胞从组织块中分离出来,同时加3-5毫升含5%FBS的培养基冲洗不锈钢滤筛,这样就获得了所需要的淋巴细胞悬浮液,下一步将通过淋巴细胞分离液分离所获得的悬液。然后将淋巴细胞重悬于含有1%BSA和2%FBS的FACS缓冲液中,用于通过FACS分选。将分选的细胞在含有20%FBS的1640培养基中培养用于进一步实验。在含有1%BSA和2%FBS的FACS缓冲液(PBS)中进行细胞染色。最后用抗小鼠的流式抗体染色,包括PE-ICOS抗体,APC-CD127抗体,PE-CD103抗体或APC-CD25抗体染色。使用FACS CantoII收集细胞并通过FlowJo分析。2.质粒构建和瞬时转染Invitrogen公司设计提供Foxo1和Aven的RNA干扰片段用于两基因的干扰。设计小鼠Foxo1和Aven基因的引物序列,小鼠Foxo1 Sense 5’-GGG GTA TGG CCG AAG CGC CCC AGG-3’,反义5’-TTA GCC TGA CAC CCA GCT GAG AGC-3’,小鼠Aven Sense5’-GGG GTA TGT TCG AAG CAC GT-3’,反义5’-TCA GGA AAT CAT GCT GTA GAG CA-3’。通过聚合酶链反应(PCR)剪接一系列化学合成的寡核苷酸以获得基因序列,然后将这些序列插入pCMV5载体。通过DNA测序证实所有构建体的完整性。使用Nucleofector程序U-25,根据制造商的方案使用Amaxa Basic Nucleofector试剂盒将2mg质粒转染到1×10 6个细胞中。3.定量PCR在1×106细胞中加入1mlTrizol LS试剂,提取总RNA,并使用PrimeScript RT试剂盒反转录。用SYBR qPCR SuperMix扩增cDNA,使用基因-特异性引物组:小鼠Foxo1基因,5’-TGT TTG ATT CAT TTC CTT TGG T-3’和5’-TGA TTT TCT CCG CTT ACT GTT G-3’;小鼠CD127基因,5’-AAA AGT AAA GCA TGA TGT GGC C-3’和5’-TTG AAG TAA TCG TTA TGG GGA A-3’;小鼠ICOS基因,5’–CAT TCC CAA CAC GAA CAC CTA A-3’and 5’–TCT TCA CCC CCA GAA AAC ACA G-3’;小鼠Aven基因,5’-GGG ACC AGG AAC CAG AAA AAG A-3’和5’-TAC ACA GAA GGC AAC CAG CAT T-3’;小鼠IL-2基因,5’-GAT GAA CTT GGA CCT CTG CG-3’and 5’-AGG GCT TGT TGA GAT GAT GC-3’;小鼠IL-4基因,5’-CAT CCT GCT CTT CTT TCT CG-3’和5’-CCT TCT CCT GTG ACC TCG TT-3’;小鼠IL-7基因,5’-GTT ATG GCA AAG CCA GAG CG-3’和5’-TGC GGG AGG TGG GTG TAG TC-3’;小鼠IL-15基因,5’-CCC CTT CTG TCC AGC CAC TC-3’和5’-TCC CGT CTT CG TCC AA TCT-3’;小鼠Bcl2基因,5’-GC TAC CGT CGT GAC TTC GC-3’和5’-ATC CCA GCC TCC GTT ATC C-3’。对于每个基因,将mRNA水平针对相应cDNA制备物中的GAPDH表达进行标准化。将对照设置为1.0,并且将每个基因诱导计算为与对照相比的倍数差。4.Western Blot收集5×106细胞/组,溶于RIPA缓冲液(1%脱氧胆酸钠,1%Triton X-100,150mM NaCl,0.1%SDS,10mM Tris-HCl pH7.2)中,12000rpm/min,10mins。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离总蛋白,通过电印迹1小时(110V)到聚偏二氟乙烯膜上。将PVDF膜在含有5%脱脂奶的Tris-缓冲盐水中封闭,并在Tris缓冲盐水和吐温(TBST)中用5%脱脂牛奶在4℃温育过夜。使用针对以下蛋白质的一抗:Erk1/2,p-Erk1/2,Akt,p-Akt,Stat5,p-Stat5,Aven和GAPDH;Foxo1,p-Foxo1,CD127和Bcl2。将膜用TBST洗涤3次,每次5分钟,然后按照1:2000比例在含5%TBST中添加二抗,室温下用含有5%脱脂奶的TBST中的合适的二抗温育1小时。使用增强的化学发光(ECL)试剂盒和X射线胶片曝光,观察蛋白质结合。5.染色质免疫沉淀测定和实时PCR使用Ch IP(染色质免疫沉淀)测定试剂盒根据制造商的方案进行染色质免疫沉淀测定。将细胞(1×10 6)在培养基中的甲醛(1%)中固定,然后在室温下温育10分钟。用冷PBS洗涤沉淀,并使用MISONIX XL-2000在15的功率设置下对固定的细胞进行超声处理(15个循环的30秒的超声处理,15个循环,在冰水浴中冷却60秒),以剪切DNA在SDS裂解缓冲液中。通过用蛋白A或G振荡预清洗后,将这些裂解物与4μg抗体或正常IgG在4℃下温育16小时。使用QIAquick PCR纯化试剂盒根据制造商的方案纯化免疫沉淀的DNA。接下来,纯化的DNA作为模板,小鼠Aven启动子,5’-TTT GAG CCA AGG TTC TAA CAA A-3’和5’-CCA ATA CTA ACA TCA CGG AGG G-3’为引物,检测结合在抗体上的DNA。6.流式细胞术检测细胞凋亡nTreg细胞凋亡的检测,我们是根据Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒中提供的方法执行。将nTreg细胞接种到6孔培养板(4.0×10 3个细胞/cm 2)中并培养24小时。在处理这些组之后除去培养基,然后用0.1M PBS缓冲液冲洗一次。使用0.25%胰蛋白酶消化2分钟使细胞传代,并收集在离心管中。将收集有nTreg细胞的离心管以1500r/min离心,离心5分钟后弃去上清液。将结合缓冲液(200μL)加入每个管中并涡旋。在室温下在黑暗中加入Annexin V-FITC(5μL)10分钟,并将管以1000r/min离心5分钟。将离心管上清液弃去后,再次向离心管内给予200μL结合缓冲液,并重悬细胞。将PI(5μL)加入到混合物中,于30分钟之内进行流式检测。7.MTT测定细胞增殖将细胞分成组,给予1×104细胞/孔于96孔培养板中,培养时间为1-6天。每组用不同的试剂预处理4小时。加入试剂和40μM TBHP,24小时后,除去培养基。将含有10%MTT的DMEM(100μL)加入到每个孔中并保持在37℃;4小时后,弃去培养基。加入DMSO并在黑暗中置于振荡器上10分钟。使用Bio-Rad 400酶标仪在492nm测量吸光值。结果:1.为了研究Foxo1对nTreg中IL-7Rα表达的调控作用,用Foxo1 siRNA或对照siRNA转染nTreg。我们发现与对照siRNA相比,Foxo1 siRNA组Foxo1 mRNA的表达降低超过50%。与m RNA水平一致的是,Foxo1 siRNA组中Foxo1蛋白的表达也显著下降。我们发现与对照siRNA相比,用Foxo1 siRNA处理的nTreg中CD127蛋白表达下调。相反,Foxo1过表达则增加了nTreg中CD127的表达,这表明Foxo1在CD127表达中起着重要调控作用。2.为了测试Foxo1在激活nTreg中的作用,我们检测了CD103和诱导型共刺激分子(ICOS),它们是活化的nTreg重要标记。同时,我们也用流式检测了nTreg中CD127的表达。发现和对照siRNA处理的nTreg细胞相比,Foxo1 siRNA组细胞表面的CD127、CD103和ICOS无显著变化。通过测定其平均荧光强度(MFI),发现CD127的MFI在Foxo1 siRNA处理组和对照siRNA组之间也没有显著差异。然而,CD127、CD103和ICOS在Foxo1过表达的nTreg中显著增加,CD127 MFI在Foxo1过表达nTreg中是对照组的2.6倍。CD25和Foxp3在Foxo1干扰和过表达的nTreg中变化不明显。这些研究结果表明nTreg可以通过Foxo1激活,并维持其细胞表型稳定。3.用CD3、CD28和IL-7刺激nTreg,使用MTT检测nTreg的增殖率。我们发现Foxo1过表达细胞比Foxo1 siRNA细胞中的细胞增殖率较高。但细胞增殖速率在Foxo1过表达细胞中用抗CD127抗体处理后减少。同样将nTreg在不含IL-7的情况下孵育,细胞增殖速率降低,这表明Foxo1通过调节IL-7/IL-7Rα信号传导控制nTreg增殖。4.在与CD3、CD28和IL-7孵育之前,用Foxo1-质粒转染nTreg,根据PI-Annexin V凋亡试剂盒方法测量凋亡。我们发现Foxo1过表达抑制nTreg凋亡。相反,细胞凋亡在用Foxo1 siRNA转染后的nTreg中增强。然而,Foxo1-质粒(不含IL-7)或Foxo1-质粒+抗CD127抗体组较Foxo1-质粒+IL-7组,nTreg的凋亡无显著变化,表明Foxo1抑制nTreg的细胞凋亡可以通过其他信号通路。鉴于Foxo1可能调节抗凋亡基因Aven的观点,我们证明Foxo1可以调节Aven的表达来阻滞nTreg的细胞凋亡。通过CHIP技术首先观察到Foxo1可以结合Aven启动子。此外,发现Aven mRNA表达在用Foxo1siRNA处理的nTreg中与对照相比显著被抑制。反过来,Foxo1过表达增加了nTreg中Aven的mRNA水平,而且与mRNA表达的趋同的是,Aven的蛋白水平也被明显上调。这个发现提示Foxo1调节Aven的表达。而我们检测到抗凋亡基因Bcl2的mRNA和蛋白水平在各条件之间没有差异,提示在nTreg中Bcl2可能不受Foxo1调节。5.为了检测Aven在n Treg的细胞凋亡中的作用,用Aven siRNA和对照siRNA转染nTreg。与用对照siRNA干扰的nTreg相比,Aven的mRNA和蛋白质水平在用Aven siRNA干扰的nTreg中表达下调。流式细胞术结果表明,在用Aven siRNA转染的nTreg中凋亡增加。当Aven在nTreg中过表达时,我们发现Aven表达在mRNA和蛋白水平均表现上调,并且细胞凋亡减弱。表明Aven在nTreg中具备抗凋亡的能力。此外,Foxp3+Treg主要分为两个亚组:nTreg和iTreg。我们还检测了Aven过表达和干扰后iTreg的凋亡。这些结果表明iTreg与nTreg相似,使得两种细胞类型中的凋亡可以由Aven调节。结论:1.Foxo1过表达可以激活nTreg,并能上调nTreg CD127(IL-7Rα)的表达。2.Foxo1过表达可以通过激活IL-7/IL-7Rα信号通路促进nTreg增殖。3.Foxo1可以通过促进抗凋亡基因Aven表达,抑制了nTreg的凋亡。