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围手术期脑缺血再灌注损伤并不少见且后果极其严重,脑中风一旦发生,死亡率高达33%～60%。与心肺等器官相比,针对脑缺血再灌注损伤的治疗方法有限且效果不确实。因此,寻找防治脑损伤的有效措施并在临床上推广应用是围手术期脑保护研究亟待解决的重大难题。自Wada1996年发现高压氧预处理可诱导沙土鼠前脑缺血耐受产生之后,学者们对这一预处理方法进行了大量研究,发现在心脏、肝脏和脊髓,高压氧同样可以诱导缺血耐受,减轻缺血再灌注损伤。但其具体机制远未阐明。我们以往的研究已经证实重复高压氧预处理对脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用。其机制包括激活内源性抗氧化通路,上调抗氧化物酶(CAT,SOD)活性,以及增加heme oxygenase-1 (HO-1)转录及表达。但是以上实验仅在动物水平研究高压氧预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用,高压氧预处理对脑神经元是否具有直接的保护作用尚不得而知。为了回答上述问题,并进一步阐明高压氧预处理诱导脑缺血耐受的机制,本实验以原代培养的新生鼠皮层神经元为对象,采用氧糖剥夺模拟缺血再灌注损伤,研究重复高压氧预处理对皮层神经元损伤的保护作用并对其机制进行探讨。第一部分重复高压氧预处理对皮层神经元氧糖剥夺损伤保护作用的研究目的研究重复高压氧预处理对新生鼠脑皮层神经元氧糖剥夺损伤的影响。方法建立体外培养皮层神经元氧糖剥夺(OGD)损伤模型。分为空白组(Sham)、对照组(OGD)和高压氧(HBO)组(0.35MPa,2h,5d)。通过形态学观察、SOD、CAT含量测定、甲基噻唑基四唑比色微量分析(MTT)、细胞凋亡检测和乳酸脱氢酶(LDH)测定等方法观察OGD所导致的神经元损伤以及重复高压氧预处理对这种损伤的影响。结果(1)体外培养的皮层神经元培养至8d左右,神经元的突起互相交织成网状,形成神经网络,表明神经元已成熟。(2)HBO组高压氧预处理5d后24hOGD前神经元活力与与SHAM组光密度值无明显差异。OGD后24h细胞活力下降,OGD组与HBO组和Sham组相比光密度值明显降低(P<0.05)。(3)流式细胞仪检测结果显示,在OGD后24 h,HBO组和Sham组仅有部分神经元发生凋亡,而OGD组神经元凋亡率明显增多,Sham组、HBO组与OGD组神经元凋亡率分别为2.21%、2.69%、4.71%,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)OGD后24 h OGD组与Sham组和HBO组相比,LDH释放量明显增多(P<0.05)。(5)在高压氧预处理1-5d各个时间点的SOD值三组均无显著差异;OGD后24 h与Sham组和HBO组相比,OGD组SOD值明显降低(P<0.05)。随着高压氧预处理的重复,HBO组CAT含量逐渐升高,Sham组和OGD组CAT含量变化不大。OGD后24 h三组CAT均明显降低,但HBO组仍高于其它两组(P<0.05)。结论氧糖剥夺可导致神经元出现损伤,而重复高压氧预处理对这种损伤具有保护作用。第二部分PPARγ信号参与重复高压氧处理对皮层神经元细胞氧糖剥夺损伤保护作用中的机制研究实验一PPARγ在重复高压氧处理对皮层神经元细胞氧糖剥夺保护作用中的变化研究目的研究PPARγ信号在重复高压氧预处理对新生鼠脑皮层神经元氧糖剥夺损伤保护作用中的变化研究。方法建立体外培养皮层神经元氧糖剥夺损伤模型,分为空白组(Sham)、对照组(OGD)和高压氧(HBO)组(0.35MPa,2h,5d)。分别在OGD后2、24、48hour行Western Blot和RT-PCR方法测定PPARγ蛋白和mRNA表达。结果HBO组PPARγ蛋白和mRNA的表达较OGD组和SHAM组明显增高。通过对OGD后2、24、48 h三个时间点的动态变化观察显示,缺血后2h开始有表达,随时间的推移,其表达逐渐增加,24h达高峰,48h后开始下降。但仍高于OGD组和SHAM组(P<0.05)。结论重复高压氧预处理可以使皮层神经元PPARγ表达增加,对氧糖剥夺诱导的损伤产生保护。这种保护作用的机制是通过PPARγ表达的上调实现的。实验二PPARγ激动剂和拮抗剂对重复高压氧处理诱导皮层神经元细胞氧糖剥夺保护作用的影响目的:研究PPARγ在重复高压氧预处理对抗新生鼠脑皮层神经元氧糖剥夺损伤中的作用以及PPARγ激动剂和拮抗剂对这种保护的影响。方法:建立体外培养皮层神经元氧糖剥夺损伤模型,分为空白组(Sham)、氧糖剥夺组(OGD)、高压氧组(HBO)(0.35MPa,2h)、激动剂组(ACT)和拮抗剂组(IHB)。ACT组末次预处理24小时后,罗格列酮10μM浓度加入培养基,1h后行2小时OGD,其后更换为正常培养基。IHB组末次预处理24小时后,GW9662 10μM浓度加入培养基,30min后行2小时OGD,其后更换为正常培养基。通过甲基噻唑基四唑比色微量分析(MTT)、细胞凋亡和LDH检测以及RT-PCR和Western blotting等方法,观察重复高压氧预处理后,OGD所导致的神经元损伤后不同时间点各组PPARγ蛋白和mRNA表达的变化,以及PPARγ激动剂和拮抗剂对这种保护作用的影响。结果:(1)高压氧预处理5天过程中各组光密度值无明显差异。OGD后24h各组细胞活力下降,OGD组和IHB组与HBO组、Sham组和ACT组相比光密度值明显降低(P<0.05)。HBO组和ACT组相比差异无统计学意义。(2)OGD后24h,OGD组、IHB组、HBO组和Sham组与ACT组相比,LDH释放量明显增多(P<0.05)。HBO组和ACT组相比差异无统计学意义。(3)OGD后24h,在HBO组、Sham组和ACT组仅有部分神经元发生凋亡,而在OGD组和IHB组神经元凋亡率明显增多,Sham组、OGD组、HBO组、ACT组和IHB组神经元凋亡率分别为2.82%、4.71%、3.01%、2.69%、3.47%。OGD组和IHB组与HBO组、Sham组和ACT组相比差异有统计学意义(P<0.05)。HBO组和ACT组相比差异无统计学意义。(4)PPARγ蛋白和mRNA表达:在缺血后2、24h,ACT组明显高于其它各组,差异有统计学意义(P<0.05)。缺血后24h,IHB组明显低于于其它各组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:PPARγ激动剂可以促进PPARγmRNA和蛋白表达的增加,对皮层神经元氧糖剥夺损伤有保护作用;而PPARγ拮抗剂则会逆转这种保护作用。结论1重复高压氧预处理对由氧糖剥夺导致的神经元损伤有保护作用。2高压氧预处理诱导皮层神经元缺血耐受产生的机制部分是通过上调PPARγ的表达,增强了机体在缺血再灌注过程中清除氧自由基的能力实现的。3 PPARγ激动剂可以促进PPARγmRNA和蛋白表达的增加,加强这种保护作用,而PPARγ拮抗剂则能逆转这种保护作用。