研究背景肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,具有较高的死亡率和发病率。其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是主要的肺癌病理类型,占肺癌总数的80-85%。依据病理类型,NSCLC主要分为肺鳞癌(Lung squamous cell carcinoma,LUSC)和肺腺癌(Lung adenocarcinoma,LUAD)。翻译后修饰在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用,主要包括泛素化、糖基化、乙酰化等过程,其中泛素化是最重要的翻译后修饰之一。泛素系统在多种生物学行为中发挥重要作用,涉及细胞周期调节、信号转导、受体调节和凋亡等过程。泛素化过程由E1泛素激活酶(El ubiquitin-activating enzymes,Els),E2泛素结合酶(E2 ubiquitin-conjugating enzyme,E2s)和E3泛素连接酶(E3 ubiquitin ligases,E3s)介导。Els激活泛素(ubiquitin,Ub)并将其转移至E2s以硫酯键与Ub的C末端结合,然后E3s通过与E2-Ub复合物和特定底物相互作用,介导Ub转移的最后步骤。E3s由于具有底物特异性,在整个泛素化过程中起到重要作用。研究表明,肿瘤发生、发展过程中存在多种泛素相关基因的表达异常,从而使部分癌基因过表达或抑癌基因下调,进而促进肿瘤发生、发展。E3s包含三个家族,包括同源E6.-AP羧基末端(E6-APCOOH terminus,HECT)家族,RING结构域(RING finger-containing)家族,以及RING之间指状蛋白质(RING-Between RING-RING family,RBR)家族。在哺乳动物体内,三结构域蛋白家族蛋白质(tripartite motif-containing,TRIM)含有80多个成员,其中很大一部分TRIM基因家族具有E3s活性,是E3s中的重要组成部分。近年来TRIM基因家族已经引起了很多关注,成为E3s研究领域的焦点。根据既往研究可知TRIM家族基因与恶性肿瘤的发生发展密切相关,二者之间的作用关系大致可以分成4类:一是致癌性调节,如TRIM24、TRIM25、TRIM27、TRIM28等;二是抑癌性调节,如TRIM3、TRIM8、TRIM13、TRIM16等;三是调节肿瘤转移,如TRIM8、TRIM11、TRIM16、TRIM62;四是调节DNA修复,如TRIM29。同一个TRIM家族成员在不同的肿瘤中往往表现出不同的作用。例如研究者发现膀胱癌中TRIM24高表达可以通过NF-κB等信号通路增加CyclinE、CyclinDl的表达促进肿瘤的转移,在乳腺癌中,TRIM24可以作为雌激素受体α的共刺激因子发挥作用,其表达过高提示不良预后,然而一项关于肝细胞癌的研究却提示了 TRIM24的抗肿瘤作用。TRIM家族另一个成员TRIM29也已经在多种肿瘤中进行了研究。研究表明,TRIM29在包括胃癌、膀胱癌、食道癌和胰腺癌等多种肿瘤中过表达,并且与不良预后相关。而另一项研究表明,TRIM29可通过抑制TWIST基因表达从而抑制乳腺癌上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程。这证明,TRIM 家族成员在不同肿瘤中或在肿瘤的不同阶段可能具有不同的功能。因而,全面研究TRIM家族蛋白功能,与不同肿瘤之间的联系具有非常重要的意义。TRIM家族蛋白通过与不同蛋白的相互作用,对不同肿瘤发挥着不同的作用,在肿瘤进展过程中发挥重要功能。但由于成员的数量众多且机制复杂,不同的TRIM蛋白与肿瘤组织的关系以及分子机制尚不完全清楚。依据目前的文献报道,迄今为止TRIM家族和肺癌的研究非常有限。为了更好地理解TRIM家族成员的影响和肺癌的预后价值,本研究利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中LUSC和LUAD的临床数据和RNA序列数据分析了整个TRIM家族成员的基因表达以及预后的关系,筛选TRIM家族在肺癌中起关键作用的基因,并在细胞水平进一步分析该基因对肺癌细胞的生物学作用。本研究系统分析了 TRIM基因家族与肺癌的密切关系,并通过生物信息学的方法筛选关键基因,进而通过细胞学方法验证,对于针对性靶向治疗肺癌的药物研究以及临床诊断具有重要的意义。第一部分:TRIM基因家族在非小细胞肺癌中差异表达和临床预后之间的关系研究目的:分析TRIM基因家族在非小细胞肺癌(NSCLC)中差异表达以及临床预后之间的关系,筛选TRIM基因家族中的关键基因,用于作为非小细胞肺癌临床诊断或预后的指标。研究方法:1.利用肿瘤基因组图谱(TCGA)数据集收集非小细胞肺癌的主要癌症类型肺鳞癌(LUSC)和肺腺癌(LUAD)RNA测序数据和临床数据,通过R语言的DEseq对RNA-seq数据进行筛选和标准化处理,HemI(Heatmap Illustrator,版本1.0)软件生成热图显示LUSC和LUAD样品中TRIM家族成员的差异表达。采用TCGA相关数据分析不同成员的生存预后。对LUSC与LUAD患者的临床数据与RNA序列数据之间进行整合分析,综合两种癌症类型选出TRIM家族中具有明显表达差异的成员。2.在 Online Kaplan-Meier Plotter(http://www.kmplot.com)网站采用单变量 Cox比例风险模型分析所有TRIM基因家族成员表达与临床预后的相关性,筛选具有显著的预后价值的TRIM家族成员。3.利用 Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中 GSE75037,GSE19804和GSE43458数据库的系列矩阵文件验证了TRIM15的表达差异。4.利用R2基因组分析和可视化平台36742 at数据集,分析正常组织和肿瘤组织的间TRIM15表达差异,并绘制K-M生存曲线,单变量COX回归分析TRIM15的表达与预后的关系。5.分析TRIM15与EGFR、KRAS、P53、LKB1等肺癌常见基因突变之间的关系。结果:1.TRIM家族分别在LUSC中的19名成员和LUAD中有14名成员显示出显著的差异表达,并且有10个成员TRIM2,TRIM15,TRIM16L,TRIM59,TRIM17,TRIM72,TRIM9,TRIM58,MEFV和TRIM45在LUSC和LUAD中均显示出显著的差异表达(log2FC变化值≥1,调整p值<0.05)。2.利用Kaplan-Meier生存分析对LUSC和LUAD中差异表达显著的成员绘制K-M生存曲线,使用单变量Cox比例风险模型来分析TRIM基因家族成员的预后价值。结果显示三名成员TRIM2,TRIM15和TRIM58对LUSC和LUAD预后具有明确的影响。其中,TRIM15在肺鳞状细胞癌(LUSC)中,TRIM15的Log2FC为5.16(p=0.00575),在肺腺癌中,TRIM15的Log2FC为6.37(p=6.78E-07)。上调的TRIM15与LUSC(HR 1.353;95%CI 1.023-1.789;p = 0.034)和LUAD(HR 1.560;95%CI 1.159-2.101;p = 0.003)的预后不良有关,可作为潜在靶点进行分析。3.利用GSE75037,GSE19804和GSE43458数据库的系列矩阵文件验证了TRIM15在正常组织及肺癌组织中的表达差异。在三个数据库中,肿瘤组织中TRIM15的表达显著高于正常组织(GSE75037和GSE43458中p<0.0001,GSE19804中p=0.0007)。4.R2基因组分析和可视化平台绘制36742_at数据集表达差异分析结果可知TRIM15在肺癌组织中上调(p= 2e-03)。同时,在数据集(36742_at)中绘制K-M生存曲线,单变量COX回归显示TRIM15分别与LUSC和LUAD的预后显著相关(LUSC中HR=1.3(1.01-1.68),p=0.043,在LUAD中HR=1.81(1.42-2.31),p=1.2e-06)。5.EGFR突变患者的TRIM15表达显著高于野生型患者。同时,在KRAS突变LUAD患者中,与具有高TRIM15表达的患者相比,具有低TRIM15表达的患者具有更好的预后(p=0.044)。表明TRIM15可能在KRAS突变肺癌中具有更高的活性。结论:TRIM家族中有10个成员在LUSC和LUAD中均显示出显著的差异表达,其中TRIM2,TRIM15和TRIM58在LUSC和LUAD中均显示出显著的预后价值,其中仅有TRIM15表达趋势与预期预后相符,可作为非小细胞肺癌的潜在靶点。第二部分:TRIM15在非小细胞肺癌中的表达与作用目的:确认TRIM基因家族中的靶点因子TRIM15在肺癌患者组织中的表达差异,并检测TRIM15对肺癌细胞生物学功能的影响,进一步研究TRIM15在非小细胞肺癌中的表达与作用。方法:1.采用定量实时PCR分析17对原发性NSCLC患者的肿瘤组织和配对正常组织中TRIM15的表达情况;采用免疫组化(IHC)法确认组织微阵列中35对NSCLC肿瘤组织和配对正常组织中TRIM15的表达差异;2.利用siRNA敲减人肺腺癌细胞A549中TRIM15的表达,并通过MTT检测细胞增殖能力、细胞划痕法检测细胞迁移能力、流式细胞仪检测细胞周期变化3.利用基因集富集分析(GSEA)预测TRIM15作用的生物学过程。研究结果:1.实时定量PCR结果显示在17对配对的癌组织与正常组织中,TRIM15在NSCLC组织中表达显著高于匹配的正常组织(p=0.0009)。组织微阵列分析结果显示在35对组织中,与匹配的正常组织相比,TRIM15的表达在肿瘤组织中显著更高(p<0.0001)。2.蛋白印迹法验证siRNA成功敲减了肺癌细胞系中TRIM15的表达。3.TRIM15下调后增殖能力、细胞迁移能力显著低于转染对照siRNA的对照组SiCT细胞。相比于对照组细胞,siTRIM15-1细胞在G0/G1期细胞比例上升,G2/M期细胞数下降。4.基因集富集分析显示TRIM15的高表达与糖酵解、氧化磷酸化、细胞周期和与蛋白酶体和干扰素相关的生物学进程密切相关(p值均小于0.001)。研究结论:TRIM15在肺癌患者肿瘤组织中高表达,敲减TRIM15可抑制肺癌细胞A549的增殖、迁移与周期变化,TRIM15可能参与细胞糖酵解、氧化磷酸化、细胞周期、蛋白酶体和干扰素-α等生物学进程。