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2型糖尿病(Type2diabetes,T2DM)的一个显著病理特征是体内不可溶的纤维沉积在胰岛β细胞内,这种纤维就是强聚集性的人胰岛淀粉样多肽(human islet amyloid polypeptide,hIAPP)。 近年来的研究表明,对胰岛β细胞产生毒性,导致胰岛β细胞损伤或凋亡的是hIAPP聚集初期形成的寡聚物中间体而非聚集后期产生的成熟纤维。关于hIAPP寡聚物生理毒性的机制,目前还没有统一的说法。但越来越多的实验表明,胰腺组织里线粒体功能失调及其介导的氧化应激和氧化损伤在胰岛β细胞损伤或凋亡过程中发挥着重要作用。氧化应激或氧化损伤条件下,人体中血红素(heme)过氧化物酶活增加,促进蛋白质酪氨酸发生硝化,影响蛋白质正常的结构和功能。有研究指出T2DM患者体内蛋白质硝化水平显著增加,表明了hIAPP与之有直接的联系,但其分子机制目前还不是很清楚。此外,对糖尿病人尸检发现,人体中heme的代谢失调与T2DM的发生发展密切相关,提示heme可能在hIAPP诱导胰岛β细胞损伤中发挥重要作用。为了探究hIAPP在酪氨酸发生硝化后对hIAPP结构和功能的影响,阐明硝化在T2DM中的分子机制,以及验证heme与hIAPP的相互作用能够在T2DM中扮演重要角色,本文从以下两个方面对其分别进行研究: (1)Heme抑制hIAPP聚集及解离hIAPP聚集体的机理。选取hIAPP三种突变多肽,研究突变后的多肽与heme的相互作用。结果显示,heme能够有效的抑制hIAPP及其突变多肽的聚集并能对已经形成聚集体进行部分解聚。hIAPP中His18和Arg11在抑制聚集中起到了重要作用。对照组实验表明尽管heme铁中心对与hIAPP结合非常重要,但并不是抑制聚集所必须的。本文推断heme可能通过阻碍分子间Phe23芳香环-芳香环堆积形成的β-折叠结构的作用从而抑制hIAPP的聚集。在结合上heme以后,hIAPP更倾向于形成寡聚体,而寡聚体被认为是导致胰岛β细胞凋亡的重要贡献者。以上实验结果揭示了heme与hIAPP的相互作用,将有助于理解heme和T2DM之间的联系。 (2)hIAPP多肽中酪氨酸硝化对其自身聚集以及INS-1细胞毒性的影响。斑点印迹实验验证hIAPP经heme-H2O2-NO2-处理可以使酪氨酸硝化。紫外吸收光谱和过氧化物酶活实验表明酪氨酸硝化不影响hIAPP与heme的结合以及形成的heme-hIAPP复合物的过氧化物酶活。一系列聚集实验显示,酪氨酸硝化可以有效降低自身纤维化程度。细胞实验显示酪氨酸硝化增加了对INS-1细胞的毒性。这些研究揭示了硝化后的hIAPP通过增加低分子寡聚物的数量进而增加胰岛β细胞毒性。实验结果为胰岛内硝化水平的提高和T2DM发生发展之间的关联提供了一个合理的解释。