猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)及流行性乙型脑炎病毒(JEV)是引起猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)的三大主要病毒性病原,临床上常与免疫抑制性病毒：猪瘟病毒(HCV)、猪呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2)等和一些细菌性疾病等混合或继发感染,除引起严重的繁殖障碍外,更导致猪病临床症状复杂多变性,增加治疗和防控的难度,造成巨大经济损失。为节约人力简化免疫程序、降低免疫干扰、减小动物应激、鉴别疫苗与野毒,研发一种高效、稳定、安全、方便的新型疫苗来同时预防和控制好当前三种病毒病,是最大幅度降低猪繁殖障碍性综合征(SMEDI)及相关疫病行之有效的途径。PRV活载体和PPV VP2病毒样颗粒的联合应用,为发展新型动物疫苗提供了思路。本研究开展了对四川省猪场猪只PRV和JEV的血清学调查,以掌握其流行现状；研究了密码子优化的JEV多抗原表位串联基因e与PPV VP2嵌合DNA疫苗；并以猪伪狂犬病毒疫苗株SA215为载体,构建了JEV-PPV-PRV活载体疫苗。主要研究内容如下：1、四川省部分猪场伪狂犬和乙型脑炎的血清流行病学调查采用PRV gE ELISA检测试剂盒对2009年-2010年以四川省18个地区的27个具有代表性大中小型猪场不同批次送检的血清1177份进行了伪狂犬野毒的检测,并对数据进行了统计分析。结果显示,各猪场平均gE抗体阳性率为8.2%,阴性猪场占59.3%,川东北区阳性率最高为18.8%,公猪野毒感染率最高达7.4%,基础母猪规模为100头以下的小型猪场猪只伪狂犬野毒阳性率最高为52.7%。对四川省10个地区的14个猪场进行PRVgB抗体ELISA检测,结果显示,各猪场gB抗体阳性率从最低的66.7%到最高100%,14个猪场平均抗体阳性率达87%,表明四川省PRV的免疫情况参差不齐,差异较大。采用JEV抗体ELISA检测试剂盒对四川14个地区21个规模化猪场从2009年2月至2010年10月的1100份样品进行了检测,并对数据进行了统计分析,结果显示,JEV抗体总阳性率为75.1%,川西区抗体阳性率最高为83.6%,4月份抗体阳性率逐渐升高,到5月份阳性率达到第二高水平92.1%。将826份JEV ELISA检测为阳性的样品按照猪群类别分类随机抽样20%,采用JEV RT-PCR进行检测,结果显示,后备猪阳性率为6.5%最高,表明四川省猪群存在JEV感染。2、乙脑E基因多抗原表位基因的设计和原核表达通过生物信息学方法对JEVE蛋白抗原表位进行了预测,结合文献报道筛选出5个B细胞表位和1个T细胞表位,为了增强细胞免疫应答引入通用辅助T细胞表位(PADRE),选取合适的接头Linker序列将各表位进行不同顺序线性串联组合,初步优化获得基于多抗原表位疫苗分子的氨基酸序列,并用生物软件对串联的乙脑多表位肽进行了分析评价。以原核表达质粒pET-32a为载体,构建了含JEV多抗原表位串联基因的原核表达质粒pET-e,经IPTG诱导成功表达,Western blot结果表明,JEV阳性血清能特异性识别JEV多抗原表位串联基因e的表达产物,表明JEV多抗原表达蛋白e具有免疫原性,为后续研究奠定了基础,以便应用于基因疫苗研制。3、猪细小病毒VP2蛋白N端甘氨酸富集区的缺失对病毒样颗粒的形成及免疫原性的影响PPV VP2蛋白N端连续9个甘氨酸富集的编码区是VP3蛋白的切割位点,常规PCR扩增容易导致该区段的缺失,为研究该缺失对PPV VLPs的影响,探索VP2病毒样颗粒上适合外源基因插入的位点,笔者构建了该区段缺失的VP2的真核表达载体pCI-△VP2,并以完整VP2作为对照,采用脂质体介导法转染Vero细胞,通过生物信息学技术,SDS-PAGE和Western-boltting,间接免疫荧光以及正染和免疫电镜对表达产物进行分析观察；进一步将重组质粒以核酸疫苗的方式直接肌注免疫小鼠,采用间接ELISA试验,淋巴细胞增殖试验和T细胞亚群流式细胞技术,分析免疫小鼠的体液和细胞免疫应答。结果显示,缺失△VP2和完整VP2在Vero细胞中均能自我装配成VLPs,并具有与完整病毒粒子类似血凝性,pCI-△VP2和pCI-VP2均可诱导小鼠产生较强的特异性体液免疫应答和良好的细胞免疫应答。结果表明,甘氨酸富集区的缺失不影响VP2病毒样颗粒的装配和免疫原性,△VP2同样可进行PPV VPLs疫苗和抗原转运载体的研制,为VPLs载体改造和修饰位点的探索提供了新方向,为VP2基因结构与蛋白质功能的关系提供了新的理论依据4、密码子优化的JEV多抗原表位e与PPV VP2嵌合真核表达载体pCI-Ve的构建按照哺乳动物密码子偏爱性对JEV多抗原表位串联基因e进行了密码子优化,人工合成密码子优化的e基因,将密码子优化的e基因连接到PPV VP2的N端,以真核表达载体pCI-neo为基础,分别构建了含密码子优化的JEV多抗原表位e的pCI-e和密码子优化的JEV多抗原表位与PPV VP2嵌合基因Ve的真核表达质粒pCI-Ve。构建的重组质粒pCI-e和pCI-Ve由脂质体介导转染Vero细胞,经过SDS-PAGE和Western-blotting,以及间接免疫荧光检测,结果表明e和Ve成功表达,具有免疫原性,电镜观察重组质粒pCI-Ve的细胞表达产物,表明产物可能形成病毒样颗粒。5、JEV-PPV新型核酸疫苗的免疫效果研究将真核表达质粒pCI-Ve、pCI-e和pCI-VP2以肌肉注射方式,100μg/只剂量免疫健康昆明鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,检测其体液免疫和细胞免疫情况,同时检测了中和抗体产生情况,还通过攻毒实验对pCI-Ve的免疫保护作用进行了评价。结果表明,pCI-Ve够诱导小鼠产生良好的体液和细胞免疫应答,对致死剂量的JEV强毒攻击能提供75%的保护率,表明pCI-Ve具有作为预防猪乙脑和细小病毒病的新型DNA疫苗的潜力。6、JEV-PPV-PRV活载体疫苗的研究将密码子优化的JEV多抗原表位基因e和PPV VP2嵌合基因Ve连接到本实验室的通用PRV SA215转移载体中,构建了转移载体pPI-Ve,通过与亲本株PRV SA215同源重组,构建了重组PRV SA215(G)。经Western-blot、PCR、绿色荧光和细胞病变的观察鉴定,结果表明PRV SA215 (G)构建成功。通过在Vero细胞上的致病变效应和电镜观察表明插入外源基因Ve几乎不影响亲本株SA215的生物学特性,电镜观察到PRV SA215 (G)在Vero细胞培养物中形成比VP2病毒样颗粒稍大的类似颗粒,推测表达了Ve嵌合病毒样颗粒。猪只免疫试验结果表明,PRV SA215 (G)以106.0TCID50/只,1次性肌肉注射免疫仔猪,能诱导较好的JEV、PPV和PRV体液免疫应答,能诱导良好的Thl型和Th2型细胞免疫应答,主要为Thl型,能产生亲本株类似的中和抗体效价。表明PRV SA215(G)可作为预防JEV、PPV和PRV的活载体疫苗的优良候选株。