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目的研究不同浓度砷对体外培养人脐静脉血管内皮细胞的损伤作用；不同浓度硒对体外培养人脐静脉血管内皮细胞生长的影响；适宜浓度的硒对不同浓度砷造成的血管内皮细胞损伤的拮抗作用。方法人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)置于37℃,5%CO2,饱和湿度条件下培养。细胞处于对数生长期时进行实验。实验分组：加砷组、加硒组和加砷加硒组。加硒组硒(Se)浓度分别为0.05、0.1、0.5、1、2μmol／L。加砷组和加砷加硒组砷(As)浓度分别为0.05、0.1、0.5、1.5、3、6、12μmol／L,加砷加硒组硒浓度为0.1μmol／L,每组均设空白对照作为对照组。连续培养48h后收集细胞培养液与细胞待用。采用四唑盐·(Methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法测定细胞活性；瑞氏-吉姆萨染色(Wrigh-Giema staining)观测细胞形态,吖啶橙荧光染色(Acridine orang staining)侧定细胞凋亡的情况。检测培养液中超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidase,GSH-px)活性和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量。检测培养细胞培养液中内皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase,eNOS)及诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)活性。采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测培养液中细胞间粘附分子-1(Intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞粘附分子-1(Vasular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表达情况。采用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription polymersade chain reaction,RT-PCR)测定eNOSmRNA、iNOSmRNA表达水平。多组间比较采用方差分析,两两比较采用q检验。结果1砷对血管内皮细胞损伤作用1.1细胞形态学观察瑞氏-吉姆萨染色发现加砷组血管内皮细胞的数量随着浓度的增大而减少,内皮细胞收缩变形,细胞间隙增大,随着浓度的升高,细胞膜损伤,细胞核固缩。出现“裸核”现象,甚至可见网状的染色质结构。吖啶橙染色细胞核变形明显,聚集在细胞边缘,荧光碎片增多。1.2砷对细胞生长的影响加砷组与对照组相比,砷浓度为0.05μmol／L时,细胞生长正常(P>0.05)。砷浓度为0.1μmol／L时明显抑制细胞的生长(P<0.01),抑制作用随着培养液中砷浓度的增大而增强。1.3砷对培养液中SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响砷浓度为0.05μmol／L时,SOD、GSH-px活性和MDA含量均无显著变化(P>0.05),砷浓度为0.5μmol／L时,培养液中MDA含量明显增加(P<0.05)。随着砷浓度的升高,SOD、GSH-px活性下降,MDA含量增加(P<0.01)。1.4砷对培养液中NOS活性及细胞NOSmRNA表达水平的影响砷浓度为0.05、0.1μmol／L时,对NOS活性及NOS mRNA表达无影响,(P>0.05),随着砷浓度增大eNOS活性及eNOS mRNA表达水平逐渐减弱(P<0.01),iNOS活性和iNOSmRNA表达水平则逐渐增强(P<0.05或P<0.01)。1.5砷对培养液中ICAM-1和VCAM-1表达的影响砷浓度为0.05、0.1μmol／L时,对培养液中ICAM-1和VCAM-1表达无影响(P>0.01)；随着砷浓度的增大,两种CAM表达水平逐渐增高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。2硒对血管内皮细胞的影响通过研究硒对内皮细胞形态、细胞活性、培养液中SOD、GSH-px活性和MDA含量、内皮细胞NOS活性和NOSmRNA表达、内皮细胞的ICAM-1和VCAM-1表达的影响,0.1μmol／L硒对细胞生长无任何不良影响且有一定的积极作用,从而确定硒的干预剂量为0.1μmol／L。3硒对砷造成血管内皮细胞损伤的干预作用3.1硒对砷造成细胞形态改变的影响培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol／L硒培养细胞48 h后细胞染色观察,砷浓度0.05、1.1μmol／L细胞形态正常；随着砷浓度的增加,细胞形态逐渐不规则,细胞膜损伤加重,凋亡细胞增多。吖啶橙染色可见形荧光碎片增多。3.2不同浓度砷和适量硒对细胞活性的影响培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol／L硒培养细胞48 h后,MTT测定细胞活性,结果显示,与同剂量加砷组相比,在砷的浓度为0.1、0.5μmol／L时,细胞增殖率升高,(P<0.05)。随着砷浓度的增大,与加砷组比较,各组细胞增殖率均有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05)3.3不同浓度砷和适量硒对细胞培养液中SOD、GSH-PX活性和MDA含量的影响培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol／L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,培养液中SOD在砷浓度为0.05、0.5μmol／L,GSH-px在砷浓度为0.05、0.1μmol／L时,活性均有所升高(P<0.05)。培养液中MDA含量在砷浓度为0.05、0.1μmol／L时有所下降,差异有统计学意义(P<0.05)。3.4不同浓度砷和适量硒对细胞培养液中NOS活性和细胞NOSmRNA表达的影响培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol／L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,砷浓度为0.05、0.1、0.5μmol／L时,eNOS活性升高(P<0.05),砷浓度为0.05、0.1μmol／L时,iNOS活性降低(P<0.05)。RT-PCR测定结果显示,砷浓度为0.05、0.5、1.5μmol／L时,加砷加硒组eNOS mRNA含量升高(P<0.05),砷浓度为0.05、0.1、1.5μmol／L时,加砷加硒组iNOS mRNA含量有所下降(P<0.05)3.5不同浓度砷和适量硒对内皮细胞粘附分子表达的影响培养液中加入不同浓度砷和0.1μmol／L硒培养细胞48 h后,与同剂量加砷组相比,砷浓度为0.05、0.1μmol／L时,加砷加硒组细胞培养液中ICAM-1和VCAM-1含量降低(P<0.05),随着砷浓度增大,细胞培养液中ICAM-1和VCAM-1虽有不同程度降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、砷可以使内皮细胞形态发生改变,并且导致细胞的调亡；适量硒可拮抗砷对细胞的损伤。2、砷可使培养液中的SOD、GSH-Px活性降低,MDA含量增高；适量硒可改善这种现象,使SOD、GSH-Px活性明显升高,MDA含量下降。3、砷可抑制内皮细胞eNOS mRNA的表达,使培养液中eNOS活性降低；刺激iNOS mRNA的表达,使培养液中iNOS活性增强；适量硒可以改善砷对细胞NOS mRNA的影响,使eNOS和iNOS活性趋于正常。4、砷可刺激内皮细胞粘附分子的表达,使培养液中ICAM-1和VCAM-1的表达水平增高；在砷的浓度较低时,适量硒可以改善砷对细胞粘附分子的影响,使其浓度与同剂量加砷组相比有所下降。