前言 腹膜透析(PD)是终末期肾脏病替代治疗的重要手段之一，其长期有效的进行有赖于腹膜透析效能的良好维持。随着腹透患者生存率的不断提高，腹膜超滤失败、腹膜纤维化等远期并发症逐渐得到重视。长期腹膜透析患者腹膜持续暴露于酸性、高渗、高糖的非生理性透析液，导致第一道生理屏障——腹膜间皮细胞(PMCs)发生显著的形态学改变：如细胞表面微绒毛消失、细胞增大甚至细胞剥脱、间皮细胞下基质增多，一些病人可出现基底膜增厚及间质中微血管壁增厚等糖尿病样病变，代之以大量纤维组织，形成无细胞区最终导致腹膜纤维化。上述结构改变会影响腹膜的透析效能：腹膜的通透性增加、葡萄糖(Glc)吸收加快，导致超滤下降。大量研究表明：高糖是造成PMCs损害进而导致透析效能下降、超滤能力丧失及腹膜纤维化的主要原因。腹膜间皮细胞可产生细胞外基质，它参与基底膜的构成对维持其结构的完整起重要作用。腹膜纤维化的组织学检查发现细胞外基质明显增多。因此有必要研究和探讨高糖对PMCs细胞外基质产生的影响，为减轻腹膜纤维化提供新的途径。而PMCs的体外培养则为该研究提供了细胞模型。 已有研究表明：肾小球系膜细胞在糖尿病相关因素：蛋白激酶C(PKC)激活剂——佛波酯(PMA)的作用下上调，并伴有细胞对Glc净利用的增加以及伴有细胞外基质的合成增加；参与了糖尿病肾病的发生发展。我们已完成的实验表明：PMCs暴露于高糖情况下，刺激了HKs在PMCs的表达，因此有必要进一步研究高糖在刺激HKs活性增加的同时是否也刺激了PMCs细胞外基质的合成及分泌。 本实验利用原代培养的PMCS，主要研究糖尿病相关因素：高糖对PMCS细胞外基质合成及分泌的影响；并观察PKC ＄活剂（PMAXPKC抑制剂（Glib976）对细胞外基质合成及分泌的影响，为进一步探讨如何减少细胞外基质的合成及分泌从而为减轻腹膜纤维化提供新的理论依据。 实验材料与方法 实验材料 1．实验动物：雄性SD大鼠 2．实验用细胞：原代培养的腹膜间皮细胞 3．细胞培养、传代及鉴定的相关试剂 4．检测细胞外基质层粘连蛋白（LNX IV型胶原（coilN）的放免试剂盒 实验方法 1．胰蛋白酶消化法进行大鼠PMCS的原代培养 2．间接兔疫荧光法用于PMCS的鉴定 3．观察不同浓度的葡萄糖、PMA及PKC抑制剂对细胞外基质层粘连蛋白（LN入 IV型胶原（colllV）影响 4．放免法测定细胞培养液中LN／Ollw的含量 实验结果 1．高糖对腹膜间皮细胞m、Cdw合成的影响呈浓度依赖性。 O）葡萄糖浓度为2．5％人．25％的培养液剩激PMC824 b，LN分另增加2．7倍J．3倍（P＜o．opes）。 ＊）葡萄糖浓度为1．5％在．5％／．25％的培养液刺激PMCs双h，Cd＊删增加ic．7倍、14．8倍（P＜o．4his）、29倍（P＜o．pl）。 ·2·成亦增加，且有显著意义。 3．二 pmml／L PMA可使 PMCs LN、coilN合成增加 PAM组与对照组相比 LN增加 7．9倍门＜0．0005h Cdw增加 32倍汀＜0．0000）。 4．G｛：）o976抑制了PMA对LN／ 的合成的影响。 PMCS暴露于20WilL e6976的培养液30分钟后再予1卜nuno＊L＊＊A双h m、con w无明显增加（P＞O．05）。 讨 论 一、腹膜间皮细胞的体外培养及鉴定 采用大鼠网膜作为细胞来源，采用改良胰酶消化法原代培养。传代，经免疫荧光鉴定：细胞角蛋白抗体在胞浆内呈绿色荧光，证实培养细胞为腹膜间皮细胞。 二、高糖对PMCS细胞外基质合成的影响 人体各种组织均有细胞外基质（ECM）构成支架，其可分为基底膜和间质两大部分J型胶原hmwX层粘连蛋白（LN入纤维粘连蛋白（F’N）都是ECM的重要组成部分，三者均参与基底膜的构成并对维持其结构的稳定起重要作用。腹膜间皮细胞能够生成细胞外基质。我们在细胞及分子水平报道了高浓度葡萄糖夕MA等糖尿病相关因素对细胞外基质合成的影响，发现葡萄糖以浓度依赖的方式增加 LN／ IV的合成；PMA可增加 LN／ 合成；ho976阻断T PMA对LNJ 合成的影响。 三＊KC的中心环节作用 PKC是一组依赖Ca＊和磷脂的蛋白激酶，在体内由胞内第二信使二脂酷甘油（DAG）激活。已有实验证实高糖通过从头合成途径产生DAG从而成为PKC激活剂，而高糖通过PKC途径对HKs活性的激活，使间皮细胞对GIC的摄取增加，导致细胞内GIC过利用，一方面使细胞外基质合成增加，将参与腹膜纤维化的形 ·3·成，与透析效能下降有关；另一方面将促进糖基化终产物（AGE）的沉积及基底膜增厚，使腹膜通透性增加，因而与超滤下降有关。我们的实验也证实正常糖浓度下PMA可增加细胞外基质的合成，而且该作用可被PKC抑制剂所抑制。 综上所述：高糖通过使 PMCS细胞外基质合成增加参与了PMCS损害的发生发展过程，PKC在调节过程中起中心环节作用。我们的?