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目的:选定有效病毒载体,建立听神经病的动物模型,研究双链小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)介导的大鼠活体耳蜗内髓鞘蛋白零(MPZ)基因表达的抑制效应,从而探讨听神经脱髓鞘之病理生理改变。
方法:1.大鼠活体耳蜗注射多种病毒后,荧光显微镜及光镜检查腺病毒载体对内耳细胞的转染效果,根据其转染效果选定有效病毒载体,根据RNA干扰技术原理,采用耳后下进路圆窗注射腺病毒载体。
2.利用Intelligent Hearing System Smart EP2.22系统检测手术前后大鼠听性脑干电位(ABR)情况,并统计分析所测结果数值,观察比较耳蜗导入载体前和导入载体1、3、7、14天后ABR的潜伏期及反应阈的变化情况。
3.将清洁级SPF Wistar雄性大鼠随机分成7组:正常对照组、空白对照组、阴性对照组、1天组、3天组、7天组和14天组。所有动物均以右耳作为手术耳,左耳(对侧)作为内部对照。病毒载体导入干扰后,根据分组用Trizol Reagent试剂同时提取各组大鼠耳蜗螺旋神经节组织的蛋白和RNA,通过Western Blot方法检测内耳组织MPZ蛋白表达情况,半定量RT-PCR方法检测内耳组织MPZ mRNA表达情况。
结果:腺病毒Ad5在大鼠耳蜗内转染效果最好,被定为病毒载体,导入Ad5-siRNA载体术后第一天ABR各波潜伏期延长,ABR反应阈增高,耳蜗听神经髓鞘蛋白零mRNA在第一天即稍有降低,髓鞘蛋白零蛋白在导入载体第一天开始便稍有下降,后皆继续下降并维持较低水平至14天。
结论:Ad5-siRNA载体在体内能有效的敲除髓鞘蛋白零基因,达到降低髓鞘蛋白零蛋白含量的目的,其诱发的听神经脱髓鞘改变导致ABR各波潜伏期延长,Ⅲ波反应阈值增高,类似临床所见听神经病之表现。为听神经病与MPZ基因的沉寂诱导的听神经脱髓鞘的相关性研究方面提供了部分新的依据。