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研究背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是世界上常见的消化道恶性肿瘤之一,据统计显示,2018年CRC在全球癌症中的发病率与死亡率均为第三位。在国内,结直肠癌的发病率和死亡率也逐年增加,据报道,2020年CRC在我国的发病率为第三位,死亡率为第五位。结直肠癌患者早期会因为没有典型的临床症状而耽误诊治,使其就诊时就已经进入中晚期,复发率和死亡率较高,严重威胁人类健康。因此找到结直肠癌发生及转移的分子学机制,对预防、诊断和治疗结直肠癌尤为重要。M~6A被称为N6甲基腺苷化,是指腺嘌呤(A)第六位N在甲基转移酶的作用下发生的甲基修饰,最常发生在mRNA上,可以调节mRNA的转录和翻译,与癌症的发生发展有密切关系。M~6A甲基化是由一系列甲基转移酶、去甲基化酶和读取蛋白调节的动态可逆的过程。METTL3是第一个被发现的m~6A甲基转移酶,是一类写入蛋白,它与METTL14和WTAP形成的复合体,可以使mRNA发生m~6A甲基化修饰。近年来的多种研究显示,METTL3与急性髓细胞白血病,肝癌,肺癌和乳腺癌等癌症密切相关。目的:本研究旨在检测METTL3在结直肠癌患者癌组织及癌旁正常组织中的表达情况并分析其与结直肠癌患者的临床病理特征的相关性,初步研究METTL3在结直肠癌细胞增殖中的作用等生物学功能,进而探讨METTL3在结直肠癌中可能发挥的潜在机制。方法:1.收集2014-2017年期间郴州市第一人民医院普外科住院患者中外科手术的结直肠癌患者的癌组织及其匹配的癌旁正常组织标本(癌旁正常组织标本为距离肿瘤组织边缘>2cm),成功收集到46例结直肠癌组织标本。2.采用qRT-PCR(实时荧光定量PCR)检测METTL3 mRNA在46例结直肠癌患者的癌组织及癌旁正常组织标本中的表达情况并结合结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移等临床病理特征进行相关性分析。3.通过CRISPR/Cas9敲除结直肠癌细胞HCT116中METTL3(KO组),采用CCK8和细胞克隆形成实验,对比METTL3敲除组(KO组)和对照组(gRNA Ctrl)细胞的增殖情况。4.M~6A测序分析的步骤是:首先通过特定抗体标记存在m~6A修饰的RNA片段,然后富集并纯化RNA片段,与Input样品共同开展高通量测序,结合生物信息学实现m~6A修饰峰检测、motif预测分析、筛选差异基因,对peaks相关基因集合的注释进行功能富集分析。结果:1.METTL3 mRNA在CRC组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织标本(p<0.05),结直肠癌组织中METTL3 mRNA的表达量为癌旁正常组织的平均倍数为3.39倍,在46例结直肠癌患者中,有34例(73.9%)癌组织中METTL3 mRNA的表达水平明显高于其配对的癌旁正常组织。2.METTL3 mRNA的表达水平与肿瘤部位(p=0.039),肿瘤大小(p=0.038)密切相关,具有统计学意义,而与患者年龄、性别、肿瘤分化、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分级等无关(p>0.05),无统计学差异。3.METTL3 KO组细胞中METTL3蛋白表达水平较gRNA Ctrl组显著降低,证明敲除成功。CCK8和细胞克隆形成实验结果显示,与gRNA Ctrl组相比,KO组的细胞增殖能力显著下降。4.通过m~6A测序发现,gRNA Ctrl组更高的基因(如COL3A1,NBPF14,NBPF25P),为METTL3正调控的基因,而KO组更高的基因(如ROCK2,TAOK1,SEPT7),为METTL3负调控的基因。KO组特有peak中GO功能主要富集在protein binding,nucleoplasm,nuleus;KEGG通路主要富集在P13K-Akt-signaling-pathway,Small-cell-lung-cancer,Pathways-in-cancer。结论:1.METTL3 mRNA在CRC组织中呈高表达状态。2.CRC组织中METTL3 mRNA的表达水平与肿瘤部位,肿瘤大小密切相关(p<0.05)。3.METTL3可以促进CRC细胞增殖。