【摘 要】
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目的:乳腺癌易感基因BRCA1连接环指蛋白1(BRCA1-associated RING domain1,BARD1)与肿瘤发生、发展密切相关,但机制不清。本研究首先构建人真核细胞HEK293T BARD1基因敲除与过表达细胞模型,观察BARD1基因敲除和过表达后对BRCA1、p53、Aurora-A基因表达以及细胞增殖的影响,为后期肿瘤细胞的生物治疗奠定基础。方法:构建BARD1敲除质粒和BAR
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目的:乳腺癌易感基因BRCA1连接环指蛋白1(BRCA1-associated RING domain1,BARD1)与肿瘤发生、发展密切相关,但机制不清。本研究首先构建人真核细胞HEK293T BARD1基因敲除与过表达细胞模型,观察BARD1基因敲除和过表达后对BRCA1、p53、Aurora-A基因表达以及细胞增殖的影响,为后期肿瘤细胞的生物治疗奠定基础。方法:构建BARD1敲除质粒和BARD1过表达质粒,利用阳离子聚合物聚乙烯亚胺(PEI)转染对数期人胚肾上皮HEK293T细胞,在转染48h后通过荧光显微镜观察细胞转染效率;取对数生长期的人胚肾上皮HEK293T细胞,种于六孔板中,分为正常组(不做任何处理)、阴性对照组(转染空质粒)、敲除组(转染BARD1敲除质粒)、过表达组(转染BARD1过表达质粒);转染48小时后制备细胞总RNA和总蛋白,采用实时荧光定量PCR法和Western-blot鉴定人胚肾上皮HEK293T细胞中BARD1、BRCA1、p53、Aurora-A表达情况,采用上述同样分组在96孔板上进行MTT实验检测敲除BARD1与过表达BARD1后细胞增殖活性的变化。结果:转染48小时阴性对照组和敲除组HEK293T细胞内可见明显绿色荧光,实时荧光定量PCR结果均显示,相对于阴性对照组,敲除组BARD1在mRNA表达明显降低,有显著统计学差异(p<0.05);过表达组mRNA表达水平明显升高,有显著统计学差异(p<0.01);相对于阴性对照,敲除组BRCA1 mRNA表达水平组显著升高(p<0.01),过表达组BRCA1 mRNA表达水平明显降低(p<0.05);相对于阴性对照,敲除组Aurora-A mRNA表达水平组明显降低(p<0.05),过表达组Aurora-A mRNA表达水平明显降低(p<0.05)。Western-blot结果显示,相对于阴性对照组,敲除组BARD1蛋白较表达有显著性降低(p<0.05),过表达组BARD1蛋白表达有显著升高(p<0.05);相对于阴性对照组,敲除组BRCA1蛋白表达有显著性升高(p<0.05),过表达组BRCA1蛋白表达显著降低(p<0.05);相对于阴性对照组,敲除组Aurora-A蛋白表达有显著性降低(p<0.05),过表达组Aurora-A蛋白表达显著降低(p<0.05);相对于阴性对照组,敲除组p53蛋白表达有显著性降低(p<0.05);过表达组p53蛋白表达显著降低(p<0.05);MTT结果显示48h后敲除组(p<0.05)和过表达组(p<0.05)的细胞生长明显受到抑制。结论:BARD1敲除和过表达HEK293T细胞系建成功,并能在人真核细胞HEK293T细胞内表达,影响Aurora-A、p53以及BRCA1蛋白表达变化。敲除BARD1基因、过表达BARD1基因影响细胞增殖活性,为后期肿瘤细胞BARD1基因的研究奠定基础。
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