目的:探索不同冻存条件对人颗粒脂肪活力的影响,寻求更为满意的颗粒脂肪冻存条件,为临床自体脂肪移植提供理论依据。方法:常规方法收集41例自体脂肪移植求美者大腿内侧颗粒脂肪标本,经生理盐水漂洗2次静置分离后加入相应留存脂肪量等体积的含60%小牛血清+25%DMEM高糖培养基(Dulbecco Modified Eagle Medium,伯克改良伊格尔培养基)+15%DMSO(Dimethyl sulfoxide,二甲基亚砜)低温冻存保护液冻存。将所获脂肪标本一式三份,按照-20℃(普通冰箱)、-80℃(深低温冰箱)和-196℃(液氮)3种不同条件下冻存。选择冻存3个月和6个月的标本复温,通过苏木精-伊红(HE)染色观察脂肪细胞形态、台盼蓝染色法分析脂肪细胞存活率、肌酸激酶测定酶活力、免疫组化CD105检测脂肪干细胞数量,比较三种冻存温度下冻存3个月及6个月后脂肪细胞活力变化情况。应用经三种温度冻存6个月后的颗粒脂肪组织进行裸鼠体内移植建模,于6只裸鼠背部皮下进行注射移植,4周后取出,测量体积、HE染色及透射电镜观察并比较移植后脂肪组织的成活及血管化情况。所有数据均采用SPSS17.0统计包进行数据处理及分析。结果:1.体外检测脂肪细胞活力:(1)台盼蓝染色法脂肪细胞计数分析脂肪细胞存活率,-20℃、-80℃、-196℃三种温度下冻存3个月后的脂肪细胞存活率分别是18.79±2.51%、86.21±1.51%、90.05±2.77%;冻存6个月后分别是8.67±1.83%、81.34±2.39%、89.31±2.65%,三组组间比较Ρ值均<0.05,差异有统计学意义。在同一冻存时间下,-20℃、-80℃及-196℃各组的脂肪细胞存活率逐渐升高,-196℃温度冻存后存活的脂肪细胞数量最多,-20℃温度下冻存后存活脂肪细胞数量最少(Ρ<0.05)。在同一冻存温度下,-20℃及-80℃冻存3个月组的脂肪细胞存活率明显高于6个月组,-196℃下两组冻存时间无显著性差异(Ρ>0.05)。(2)肌酸激酶测定,-20℃、-80℃、-196℃三种温度下冻存3个月后的OD值是0.042±0.003、0.072±0.002、0.081±0.002;冻存6个月后分别是0.038±0.002、0.063±0.002、0.079±0.003,三组组间比较Ρ值均<0.05,差异有统计学意义。相同温度下,-20℃和-80℃冻存3个月的酶活力高于冻存6个月(Ρ<0.05),-196℃冻存温度下,3个月及6个月无差异(Ρ>0.05);相同冻存时间下,-196℃组酶活力最高,-80℃组次之,-20℃组最低(Ρ<0.05)。(3)各组HE染色显微镜下比较脂肪细胞形态发现,-20℃条件下冻存3个月组细胞膜破裂严重,网状连接部分中断,偶可见细胞核存在;而6个月组细胞膜破裂更加严重,网状连接中断,细胞核几乎消失,且存在较多坏死区及囊腔和空泡;-80℃组两段时间较-20℃组明显改善;-196℃条件下冻存3个月及6个月两组间脂肪细胞形态基本保持正常,冻存后基本未受损伤。各组经免疫组化CD105染色后,-20℃组未见ADSCs,在-80℃组及-196℃组仅见少数ADSCs。2.颗粒脂肪裸鼠移植建模:注射移植冻存颗粒脂肪于裸鼠背部皮下,4周后取出,经-20℃、-80℃及-196℃三种温度冻存6个月的颗粒脂肪移植后体积减少率分别为90%、65%、55%。HE染色形态学观察发现,-20℃组脂肪细胞形态尚可,网状纤维欠发达,仍可见细胞膜破裂情况,其余两组存活状况良好,可见完整脂肪小叶结构,细胞形态逐渐趋于稳定,部分血管长入。透射电镜观察冻存脂肪移植4周后细胞超微结构,-20℃组含较多新生脂肪细胞,-80℃及-196℃组脂肪细胞更加成熟,-196℃组已可见成熟脂肪细胞轮廓,并且在脂肪细胞周围长入的新生毛细血管数量最多。结论:1、使用经冻存的颗粒脂肪组织进行移植具可行性。2、-196℃冻存组脂肪细胞活性优于-80℃及-20℃冻存组。3、-196℃下可冻存6个月,甚至更长时间,是较理想的冻存温度。-80℃冻存6个月后脂肪细胞活力不及冻存3个月时,可用于短期保存。不建议选择-20℃进行冻存。