论文部分内容阅读
【目的】
1.构建稳定表达HR修复底物的HEK293细胞系：HDR/293和SSA/293。
2.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor，HDACi)SAHA对DNA双链断裂(doublestrandbreaks，DSBs)同源重组修复(homologousrecombination,HR)的影响。
3.探讨聚ADP核糖基聚合酶1抑制剂(poly(ADP-ribose)polymerase1inhibitors，PARP1i)Olaparib对DNA双链断裂的HR修复的影响。
4.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和聚ADP核糖基聚合酶1抑制剂Olaparib联合用药对DNA双链断裂HR修复的影响。
【方法】
将质粒HDR-GFP、SSA-GFP分别双酶切线性化转染HEK293细胞，使用嘌呤霉素筛选转染细胞获得稳定细胞株HDR/293、SSA/293，基因测序的方法对所构建细胞进行鉴定，通过流式细胞仪定量分析VP-16对HDR和SSA修复路径的影响，CCK8试剂盒检测VP-16对HEK293细胞增殖的影响；通过细胞毒性试验检测SAHA和Olaparib单独及联合用药对正常乳腺细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7和MDAMB231及HEK293细胞增殖的影响；SAHA和Olapairb单独及联合用药致DSBs的产生及对DSBs修复的影响用克隆形成实验进行检测；流式细胞仪检测细胞周期试剂盒处理后的SAHA和Olaparib单独用药及联合用药对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞周期的影响；SAHA和Olaparib单独及联合用药对HR路径修复效率的影响可以用流式细胞仪进行定量检测；RealTimePCR及WesternBloting实验可以对SAHA和Olapairb单独及联合用药对DSBsHR修复相关基因及DSBs禁锢染色质蛋白的表达进行探究。
【结果】
1．建立并鉴定整合有HDR-GFP和SSA-GFP修复底物并对依托泊苷作用敏感的细胞株HDR-293和SSA/293。
2.SAHA和Olaparib单独用药能够明显抑制MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞增殖，两者联合用药对MCF-10A具有协同作用的效果，在MCF-7、MDAMB-231及293细胞中抑制作用拮抗。
3.SAHA和Olaparib单独用药能够明显抑制MCF-7、MDAMB-231和293细胞的克隆形成，联合用药时在MCF-7细胞中不具有加合作用，在MCF-10A、MDAMB-231及293细胞中具有协同作用。
4.SAHA和Olaparib对单独及联合用药对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231及293细胞的周期均无影响。
5.SAHA对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞的SSA修复呈促进作用，却对MCF-7、MDAMB-231和293细胞的HDR修复途径无明显作用；Olaparib能使MCF-10A的SSA修复效率增高，对MCF-7、MDAMB-231、293的SSA途径无明显效果；但是Olaparib却能促进MDAMB-231的HDR修复效率，SAHA和Olaparib联合应用没有表现出协同的效果。
6.在MCF-10A细胞中，SAHA和Olaparib都能使CtIP、Mre11、Rad52、RAD51及KU80的mRNA的表达降低；SAHA使HR修复相关染色质结合蛋白RAD52、RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ的募集水平降低；Olaparib则使HR修复相关染色质结合蛋白RAD52、RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ的募集呈升高的趋势；DSBs修复相关染色质结合蛋白LigⅢ的表达无论是在SAHA给药组还是Olaparib给药组都升高了；联合用药没有表现出协同的效果。
7.在MCF-7细胞中，SAHA使HR共同通路相关基因CtIP和Mre11的mRNA表达升高，使HDR修复关键基因RAD51和NHEJ修复关键基因KU80的mRNA表达却降低，致SSA修复关键基因RAD52的mRNA表达无变化；SAHA使HR修复相关的染色质结合蛋白RAD52、XPF-ERCC1、LigⅢ、LigⅠ的募集下降，致RAD51蛋白无明显变化；Olaparib使CtIP、Mre11、RAD51和KU80的mRNA表达升高，对RAD52的mRNA表达无显著变化；Olaparib降低MCF-7细胞中的DSBs修复染色质结合蛋白RAD52、XPF-ERCC1、LigⅢ、LigⅠ的募集水平，对HDR修复关键染色质结合蛋白RAD51的募集无显著变化，联合用药时没有表现出协同的效果。
8.在MDAMB-231细胞中，SAHA使CtIP的mRNA表达水平明显升高，对Mre11、RAD51、RAD52及KU80的mRNA表达无显著改变；Olaparib使CtIP的mRNA表达升高，致Mre11表达降低，对RAD51、RAD52及KU80的mRNA表达无变化；联合用药时无协同的作用。Olaparib对RAD51、RAD52、XPF-ERCC1、LigⅠ、LigⅢ蛋白的募集都升高，SAHA对它们却有抑制作用；此外两药联合使用时不具有协同的效果。
9.在293细胞中，SAHA使CtIP的mRNA表达升高，致Mre11的mRNA表达无改变，SAHA给药组和Olaparib给药组RAD52、RAD51、KU80的mRNA水平明显降低，Olaparib给药组CtIP、Mre11蛋白的mRNA水平明显升高，联合用药时无协同及拮抗的作用。Olaparib可使染色质结合蛋白RAD52的募集升高而SAHA则可致其募集降低；RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ、LigⅢ蛋白的募集无论是在SAHA还是Olaparib给药组中均明显降低。
【结论】
1.成功构建能对药物（VP-16）作用反应敏感的HEK293同源重组修复体系。
2.SAHA和Olaparib抑制MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞增殖和细胞克隆形成，但是不干扰它们的周期变化。
3.SAHA作用加强I-SCEⅠ诱导的DSBs执行SSA修复，乳腺癌细胞对其敏感，正常乳腺细胞MCF-10A较乳腺癌MCF-7、MDAMB-231细胞的SSA修复降低；293细胞只对高浓度SAHA敏感。
4.Olaparib加强乳腺正常细胞MCF-10A的SSA修复，对乳腺癌细胞MCF-7、MDAMB-231和HEK293细胞诱导的大片段缺失的SSA修复不敏感；联合用药时，Olaparib可干扰SAHA对SSA修复作用。
5.SAHA对正常乳腺细胞MCF-10A的HDR修复敏感，Olaparib可削弱其修复作用；Olaparib对三阴乳腺癌细胞MDAMB-231的HDR修复敏感，两药联用时具有相互干扰作用；但是对MCF-7和293细胞的HDR修复均不敏感。
6.SAHA和Olaparib均下调所检测的HR修复相关基因在MCF-10A中的转录表达，与正常乳腺细胞相比，其余癌化乳腺细胞和永生化细胞的表达调控则显紊乱。
7.染色质结合蛋白的Westernblotting结果显示SAHA对SSA和HDR修复的影响与其染色质禁锢的相关修复蛋白质水平不相关；Olaparib对SSA和HDR修复与其DSBs募集到染色质蛋白的水平相关。
1.构建稳定表达HR修复底物的HEK293细胞系：HDR/293和SSA/293。
2.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histonedeacetylaseinhibitor，HDACi)SAHA对DNA双链断裂(doublestrandbreaks，DSBs)同源重组修复(homologousrecombination,HR)的影响。
3.探讨聚ADP核糖基聚合酶1抑制剂(poly(ADP-ribose)polymerase1inhibitors，PARP1i)Olaparib对DNA双链断裂的HR修复的影响。
4.探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA和聚ADP核糖基聚合酶1抑制剂Olaparib联合用药对DNA双链断裂HR修复的影响。
【方法】
将质粒HDR-GFP、SSA-GFP分别双酶切线性化转染HEK293细胞，使用嘌呤霉素筛选转染细胞获得稳定细胞株HDR/293、SSA/293，基因测序的方法对所构建细胞进行鉴定，通过流式细胞仪定量分析VP-16对HDR和SSA修复路径的影响，CCK8试剂盒检测VP-16对HEK293细胞增殖的影响；通过细胞毒性试验检测SAHA和Olaparib单独及联合用药对正常乳腺细胞MCF-10A、乳腺癌细胞MCF-7和MDAMB231及HEK293细胞增殖的影响；SAHA和Olapairb单独及联合用药致DSBs的产生及对DSBs修复的影响用克隆形成实验进行检测；流式细胞仪检测细胞周期试剂盒处理后的SAHA和Olaparib单独用药及联合用药对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞周期的影响；SAHA和Olaparib单独及联合用药对HR路径修复效率的影响可以用流式细胞仪进行定量检测；RealTimePCR及WesternBloting实验可以对SAHA和Olapairb单独及联合用药对DSBsHR修复相关基因及DSBs禁锢染色质蛋白的表达进行探究。
【结果】
1．建立并鉴定整合有HDR-GFP和SSA-GFP修复底物并对依托泊苷作用敏感的细胞株HDR-293和SSA/293。
2.SAHA和Olaparib单独用药能够明显抑制MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞增殖，两者联合用药对MCF-10A具有协同作用的效果，在MCF-7、MDAMB-231及293细胞中抑制作用拮抗。
3.SAHA和Olaparib单独用药能够明显抑制MCF-7、MDAMB-231和293细胞的克隆形成，联合用药时在MCF-7细胞中不具有加合作用，在MCF-10A、MDAMB-231及293细胞中具有协同作用。
4.SAHA和Olaparib对单独及联合用药对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231及293细胞的周期均无影响。
5.SAHA对MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞的SSA修复呈促进作用，却对MCF-7、MDAMB-231和293细胞的HDR修复途径无明显作用；Olaparib能使MCF-10A的SSA修复效率增高，对MCF-7、MDAMB-231、293的SSA途径无明显效果；但是Olaparib却能促进MDAMB-231的HDR修复效率，SAHA和Olaparib联合应用没有表现出协同的效果。
6.在MCF-10A细胞中，SAHA和Olaparib都能使CtIP、Mre11、Rad52、RAD51及KU80的mRNA的表达降低；SAHA使HR修复相关染色质结合蛋白RAD52、RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ的募集水平降低；Olaparib则使HR修复相关染色质结合蛋白RAD52、RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ的募集呈升高的趋势；DSBs修复相关染色质结合蛋白LigⅢ的表达无论是在SAHA给药组还是Olaparib给药组都升高了；联合用药没有表现出协同的效果。
7.在MCF-7细胞中，SAHA使HR共同通路相关基因CtIP和Mre11的mRNA表达升高，使HDR修复关键基因RAD51和NHEJ修复关键基因KU80的mRNA表达却降低，致SSA修复关键基因RAD52的mRNA表达无变化；SAHA使HR修复相关的染色质结合蛋白RAD52、XPF-ERCC1、LigⅢ、LigⅠ的募集下降，致RAD51蛋白无明显变化；Olaparib使CtIP、Mre11、RAD51和KU80的mRNA表达升高，对RAD52的mRNA表达无显著变化；Olaparib降低MCF-7细胞中的DSBs修复染色质结合蛋白RAD52、XPF-ERCC1、LigⅢ、LigⅠ的募集水平，对HDR修复关键染色质结合蛋白RAD51的募集无显著变化，联合用药时没有表现出协同的效果。
8.在MDAMB-231细胞中，SAHA使CtIP的mRNA表达水平明显升高，对Mre11、RAD51、RAD52及KU80的mRNA表达无显著改变；Olaparib使CtIP的mRNA表达升高，致Mre11表达降低，对RAD51、RAD52及KU80的mRNA表达无变化；联合用药时无协同的作用。Olaparib对RAD51、RAD52、XPF-ERCC1、LigⅠ、LigⅢ蛋白的募集都升高，SAHA对它们却有抑制作用；此外两药联合使用时不具有协同的效果。
9.在293细胞中，SAHA使CtIP的mRNA表达升高，致Mre11的mRNA表达无改变，SAHA给药组和Olaparib给药组RAD52、RAD51、KU80的mRNA水平明显降低，Olaparib给药组CtIP、Mre11蛋白的mRNA水平明显升高，联合用药时无协同及拮抗的作用。Olaparib可使染色质结合蛋白RAD52的募集升高而SAHA则可致其募集降低；RAD51、XPF-ERCC1、LigⅠ、LigⅢ蛋白的募集无论是在SAHA还是Olaparib给药组中均明显降低。
【结论】
1.成功构建能对药物（VP-16）作用反应敏感的HEK293同源重组修复体系。
2.SAHA和Olaparib抑制MCF-10A、MCF-7、MDAMB-231和293细胞增殖和细胞克隆形成，但是不干扰它们的周期变化。
3.SAHA作用加强I-SCEⅠ诱导的DSBs执行SSA修复，乳腺癌细胞对其敏感，正常乳腺细胞MCF-10A较乳腺癌MCF-7、MDAMB-231细胞的SSA修复降低；293细胞只对高浓度SAHA敏感。
4.Olaparib加强乳腺正常细胞MCF-10A的SSA修复，对乳腺癌细胞MCF-7、MDAMB-231和HEK293细胞诱导的大片段缺失的SSA修复不敏感；联合用药时，Olaparib可干扰SAHA对SSA修复作用。
5.SAHA对正常乳腺细胞MCF-10A的HDR修复敏感，Olaparib可削弱其修复作用；Olaparib对三阴乳腺癌细胞MDAMB-231的HDR修复敏感，两药联用时具有相互干扰作用；但是对MCF-7和293细胞的HDR修复均不敏感。
6.SAHA和Olaparib均下调所检测的HR修复相关基因在MCF-10A中的转录表达，与正常乳腺细胞相比，其余癌化乳腺细胞和永生化细胞的表达调控则显紊乱。
7.染色质结合蛋白的Westernblotting结果显示SAHA对SSA和HDR修复的影响与其染色质禁锢的相关修复蛋白质水平不相关；Olaparib对SSA和HDR修复与其DSBs募集到染色质蛋白的水平相关。