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基质金属蛋白酶(matrix metalloproteases,MMPs)是一类依赖于Zn2+和Ca2+的能够水解细胞外基质的金属内肽酶的总称,几乎能通过切割内部的肽键降解细胞外基质中的所有蛋白成分,并介导结缔组织的降解和组织重塑。MMPs既能调节正常的生理过程,其过度表达又对关节炎、癌症和心血管等疾病的产生和发展有着重要的影响。因此,研究MMPs及其抑制剂对检测和治疗这些疾病有重要意义。本论文主要研究MMP-13的表达、纯化及复性方法,并对AlNH4(S04)2·12H20与MMP-13的抑制动力学进行研究,为研究抑制机理、合成抑制剂,研发以基质金属蛋白酶为靶点的抗癌药物奠定基质。本论文取得主要结果如下:1.基质金属蛋白酶13催化结构域蛋白的表达与分离纯化利用重组大肠杆菌表达体系在LB培养基中发酵并用IPTG诱导表达MMP-13催化结构域蛋白,目标蛋白表达率为40%以上。通过超声破碎、离心、包涵体洗涤等、得到MMP-13催化结构域蛋白包涵体,选择6M尿素作为变性剂溶解包涵体。利用Ni2+-亲和色谱对MMP-13蛋白进行纯化,通过条件优化,得到最优条件。实验中发现含有NaCl的最优条件下蛋白纯度为91.3%,质量回收率为71.5%;不含NaCl的最优条件下蛋白纯度达98%,质量回收率为57.4%。2.基质金属蛋白酶13催化结构域蛋白的复性分别比较了阴离子色谱法、尺寸排阻色谱法、透析法对MMP-13催化结构域蛋白的复性效果。阴离子复性过程中利用尿素-pH-盐三梯度方式,再利用尺寸排阻色谱脱盐,通过条件优化,得到最适复性条件:上样量为0.80mL(蛋白浓度为0.8527mg/mL),流速为0.80 mL/min,洗脱梯度时间为20 min,复性平衡缓冲液为5 mol/L尿素+1 mmol/L EDTA-Na2+20 mmol/L Tris-HCl(pH =8.0);复性洗脱缓冲液为 1 mol/L NaCl+1 mmol/L EDTA-Na2+20mmol/LTris-HCl(pH=7),脱盐条件:流速为 1.00mL/min,缓冲液为 20 mmol/L Tris-HCl(pH =7.5)。直接利用尺寸排阻色谱法复性条件与脱盐条件一样。最终得到阴离子交换色谱复性蛋白质量回收率为81.4%,活性回收率为92.9%,脱盐质量回收率为32.7%,总质量回收率为26.6%。直接利用尺寸排阻色谱法得到复性蛋白质量回收率为41.7%,活性回收率为82.0%;透析复性质量回收率为58.6%,活性回收率为65.3%,蛋白纯度为74.2%。采用阴离子交换时活性回收率最高,但复性和脱盐连续两步的色谱造成蛋白质量回收率下降,对蛋白溶液的稀释程度高;尺寸排阻复性的质量回收率高于离子色谱复性总的质量回收率,但活性回收率低。3.抑制剂对基质金属蛋白酶13催化结构域蛋白复性的影响实验发现MMP-13催化结构域蛋白在复性过程中会发生降解,影响蛋白的活性,依据课题组前期的研究基础,选择EDTA,AlNH4(S04)2·12H20,K3[Fe(CN)6]作为抑制剂加入复性缓冲液中,发现加入抑制剂能够很好的抑制蛋白在复性过程中的降解,并且加入EDTA也能较好的抑制活性蛋白在放置过程中的降解。4.基质金属蛋白酶13催化结构域的酶抑制动力学研究利用荧光底物法,考察AlNH4(SO4)2·12H2O对MMP-13的抑制动力学,根据米氏方程,得到Vmax=4.09mF.U./s,Km=0.0147mg/ml;利用Dixon作图,结合圆二色谱分析结果,得到抑制剂与MMP-13催化结构域蛋白之间的抑制类型为竞争型。