论文部分内容阅读
肿瘤通常是指机体在各种致癌因素作用下,由于某些特定染色体上的DNA损伤引起体细胞发生突变而导致其克隆性异常增生形成的新生物。胃癌在我国作为消化道高发的恶性肿瘤之一,其发病率和病死率居各种恶性肿瘤前列。然而传统的胃癌诊断方法无法打破早期诊断的瓶颈-预警,往往错过了最佳治疗时间,降低了术后生存率。近年来,伴随着分子遗传学和分子生物学的不断发展以及基因工程技术的不断进步,胃癌的基因研究也取得了较大的进展。本文第一章阐述了引发胃癌的各种因素,以及与胃癌发生相关的基因；另外对目前基因突变检测技术及影响毛细管电泳(CE)分离的各种因素及参数进行了总结。本研究采用CE结合单链构象多态性分析(SSCP)及限制性片段长度多态性分析(RFLP)方法首先通过检测胃癌组织样本中胃癌相关基因突变,筛选出高突变频率基因。然后选取具有易于获取且携带大量遗传信息的胃癌患者外周静脉血液作为检测对象,通过检测高突变频率基因的基因突变实现胃癌早期预测诊断,辅助胃癌临床早期诊断及指导临床分子药物治疗。第二章以传统的PCR技术扩增胃癌患者癌变及正常组织样品中原癌基因C-myc和抑癌基因APC、p16目的基因片段,扩增样品分别采用CE-SSCP、 CE-RFLP、聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)-SSCP、直接测序分析检测上述基因突变,并将检测结果进行简单比较,筛选出高突变频率基因。结合前期实验数据,统计结果显示,总突变率由高到低依次为：p53(33.3%)>APC(30.0%)>C-myc (20.0%)>k-ras (13.3%)>p16(5.0%)。CE-SSCP检测方法可作为大规模临床样品中基因突变的检测方法。P53基因与APC基因突变与胃癌的发生发展密切相关。第三章,第四章通过优化毛细管电泳参数建立血液中快速检测肿瘤基因突变的方法,以此方法为基础检测胃癌患者外周静脉血液样品中基因突变,并以健康受试者外周静脉血液作为对照。首先,以血液中提取的基因组DNA为模板,PCR扩增经胃癌组织部分实验筛选出的四种高突变频率基因。然后,扩增样品、变性样品和酶切样品分别经直接测序分析、CE-SSCP和CE-RFLP检测基因突变,统计总突变率。检测结果显示总突变率为p53(30.1%)>APC (24.6%)>C-myc(19.2%)>k-ras(11.0%),四种基因同时检测累积检出率可达84.9%。同时联合检测这四种基因,可提高检出率。结合临床病历资料分析基因突变与病例特性之间的关系。统计结果显示,p53和APC基因突变与胃癌分化程度相关,C-myc和K-ras基因在有淋巴结转移组基因突变率高于无淋巴结转移组。四种基因参与胃癌的发生、发展全过程,可作为胃癌早期预测诊断的检测指标。CE在DNA分离分析应用方面具有高效、高灵敏度、快速、准确等优点。胃癌的发生发展与基因突变密切相关,通过毛细管电泳法检测基因突变,建立胃癌临床早期预测诊断的方法有据可依。本研究最终结果显示通过检测胃癌患者外周静脉血液样品中四种基因的基因突变可以对早期胃癌的发生进行预测。