论文部分内容阅读
我国的养猪业日益壮大,面临的挑战也越来越多,猪病毒性传染病也在威胁着养猪业的发展。针对安徽地区猪病毒的混合感染情况,本研究在安徽省合肥市、淮北市、亳州市、蚌埠市以及六安市共收集了76份猪粪便样本,其中有29份样本来自腹泻猪群,47份来自健康猪群,并对这76份样本进行了猪病毒宏基因组检测。样本检测结果显示:在收集到的76份样本中共检测出19种猪病毒,其中猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）的感染率最高（31.58%）,共有24份样本检测到PCV,16份来自腹泻猪群,8份来自健康猪群。共有18份样本检测到两种及两种以上的猪病毒混合感染,二重混合感染率达14.47%（11/76）,三重混合感染率与四重混合感染率均为1.32%（1/76）,四重以上混合感染率为6.58%（5/76）。来自合肥市编号为AH-23的样本中检测到10种猪病毒混合感染,包括PCV、猪博卡病毒（Porcine bocavirus,PBo V）、猪星状病毒（Porcine astrovirus,PAst V）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒样病毒、猪捷申病毒、猪札幌病毒、猪血清相关环状病毒以及Porcine associated smacovirus,感染的病毒种类数最多。针对其中感染率最高的4种病毒进行全基因组序列的拼接,成功得到8株PCV、5株PBo V、4株猪库布病毒（Porcine kobuvirus,PKo V）以及1株猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSu V）的全基因组序列,并上传至Genbank获得登录号。针对这4种病毒的全基因组序列进行核苷酸同源性分析以及遗传进化树分析,以探究其进化状态。核苷酸同源性分析结果显示:8株PCV之间的全基因组同源性在94.8%～99.9%,与其它参考株的同源性在91.1%～99.7%;5株PBo V之间的全基因组同源性在46.1%～93.3%,与其它参考株的同源性在46.7%～99.1%;4株PKo V之间的全基因组同源性在88.3%～90.8%,与其它参考株的同源性在86.9%～91.3%;1株TTSu V与其它参考株的同源性在42.2%～85.6%。遗传进化树结果显示:PCV全基因组遗传进化树形成一个大分支,五个小分支,8株PCV毒株均属于PCV2,其中有1株属于PCV2a,3株属于PCV2b,4株属于PCV2d;PBo V全基因组进化树形成三个分支,其中有2株属于PBo VG1,1株属于PBo VG2,2株属于PBo VG3;PKo V全基因组遗传进化树被分为两大分支,有3株存在于同一分支;TTSu V全基因组遗传进化树形成两个大分支,其中TTSu V1形成两个小分支,本研究中的TTSu V毒株属于TTSu V1b。由于PCV感染率最高,而PCV2相对PCV1、PCV3以及PCV4来说致病性最强,因此本研究根据PCV2的保守基因Rep设计特异性引物,建立了基于SYBR Green I的实时荧光定量PCR（q PCR）检测方法,为本实验室今后对PCV2的研究提供了便利。PCV2检测方法的建立结果显示:q PCR与普通PCR的最低检出限度分别为2.79×10~1copies/μL和2.79×10~3copies/μL,灵敏度为普通PCR的100倍;特异性实验中,该方法特异性良好,与PBo V、PKo V、TTSu V、PAst V、PPV不发生交叉反应;重复性实验中,组内变异系数在0.19%～0.25%之间,组间变异系数在0.27%～0.39%之间,重复性良好;临床样本检测中,q PCR与普通PCR的检出率分别为28.9%和19.7%,q PCR准确率更高。综上所述,本研究调查的安徽省部分地区猪病毒共感染情况以及部分猪病毒的进化状态为安徽养猪业的疾病预防提供了参考,针对PCV2建立的q PCR快速检测方法在临床检测中也能提供有效的技术支持。