牙全脱位(Completely avulsed teeth，CAT)是造成儿童年轻恒牙早失的主要疾病之一。牙齿离体时间、细胞活力和微环境是影响牙再植治疗成功与否的主要因素。研究证实，当牙齿离体1个小时，且没有保存在特殊的储存液中，根面几乎找不到生活的牙周成纤维细胞，而牙根及牙槽窝中是否存有足够生活的组织细胞对外伤牙牙周组织的愈合起着决定性的作用。然而，牙外伤多为突发事件，上述因素很难在就诊前被控制，目前，临床医师多采取国际牙外伤联合委员会制定的各类牙外伤操作指南进行临床治疗，对于CAT主要依靠患者自身的再生能力来完成整个牙周组织的损伤修复，疗效十分局限，加之干扰因素较多，个体间可比性差，临床治疗难以得到突破性进展。近年来组织工程技术在牙周再生治疗中已显现出了优势，如果能在牙根表面和牙槽窝中回植足够数量的生活细胞，那么牙齿离体时间的长短对治疗效果的影响将会大大降低。研究表明牙周膜干细胞是牙周组织理想再生的首选细胞，然而自体牙周膜干细胞来源有限，尤其是在外伤牙的案例中更难获得。近年来非牙源性干细胞再生牙齿组织已成为一种选择。在诸多非牙源性干细胞中，骨髓间充质干细胞是较为成熟的一类，研究证明在适当的微环境中，骨髓间充质干细胞亦可分化成类成牙骨质细胞，类牙周膜细胞和类骨细胞，完成理想牙周复合体再生的过程，异体移植所带来的潜在风险也将会避免，这将极大推进全脱位牙再植治疗效果，降低并发症带来的失牙风险。然而将自体骨髓间充质干细胞应用于CAT延迟再植的相关研究尚未见报道，为了进一步评价此方法在临床应用中的可行性，本研究将着力探讨骨髓间充质干细胞再生牙周组织的潜力，并利用小型猪建立全脱位牙动物模型，探讨骨髓间充质干细胞再生牙周复合体的相关机理，为自体非牙源性干细胞再生牙体组织寻找理论依据。本研究包括以下三个部分:　　第一部分，小型猪骨髓间充质干细胞的体外培养和鉴定　　目的:建立稳定的小型猪骨髓间充质干细胞体外培养体系，并对所获细胞进行初步鉴定，为后期研究提供基础和前提。　　方法:以四川达硕小型猪为研究对象，全麻下抽取其髂骨骨髓血，采用Ficoll淋巴细胞密度梯度离心法处理血样，待样本分层后，吸取单核细胞层细胞进行细胞培养。倒置显微镜、流式细胞仪，细胞生长曲线，免疫组化染色，酶联免疫检测仪等对所获细胞生长特性，多项诱导分化能力和表面特异标记物进行观察和分析，初步鉴定干细胞的相关生物学特性。　　结果:镜下观分离所获小型猪骨髓间充质干细胞成长梭形涡旋式生长，生长状态良好。P1细胞克隆形成率为10.28±0.69％，活细胞比率为98.17±1.89％，流式细胞检测细胞表面特异标记物CD44和CD105呈阳性表达，分别为76.5％和92.6％; CD45和CD34呈阴性表达，分别为5.9％和2.3％。多项诱导分化实验证实小型猪间充质干细胞有成骨成脂分化潜能。　　结论:本实验采用Ficoll淋巴细胞密度梯度法成功分离获得小型猪骨髓间充质干细胞，分离所获细胞增殖能力旺盛，具有跨胚层横向分化潜能。　　第二部分，小型猪牙周膜干细胞诱导骨髓间充质干细胞牙向分化的体外研究　　目的:在体外研究小型猪牙周膜干细胞对其髂骨骨髓来源的骨髓间充质干细胞牙向分化的作用，寻找二者最佳配比比例，为证明骨髓间充质干细胞可以获得牙源性干细胞特性，具备同时再生牙周软硬组织，达到牙周理想再生的能力寻找理论依据。　　方法:应用Transwell小室法对小型猪骨髓间充质干细胞和其牙周膜干细胞进行共培养。根据两类细胞的混合比例将其随机分为3组:A组:P∶M=10∶1共培养组;B组:P∶M=1∶1共培养;C组:P∶M=1∶10共培养，单独骨髓间充质干细胞和牙周膜干细胞培养组分别为阴性对照组和阳性对照组。培养14 d，应用免疫荧光染色，实时定量PCR(Realtime-PCR)和Western blot法分别检测成骨细胞和牙周成纤维细胞的特异蛋白:scleraxis、osteocalcin(OCN)、osterix(OSX)、matrixextracellular phosphoglycoprotein(MEPE)等mRNA和蛋白水平的表达，以判定二者的最佳配比比例。　　结果:免疫荧光染色，Realtime-PCR和Western blot结果显示，A、B、C三个实验组与阴性对照组相比，牙周膜干细胞特异蛋白sceleraxis，MEPE和骨髓间充质干细胞相关特异蛋白OCN和OSX相对mRNA表达水平均出现上调。数据显示:A组对四种蛋白的表达水平最高。其中在牙周特异蛋白sceleraxis，MEPE的表达上A组与其它两组之间出现了明显的差别，差异有统计学意义P＜0.05。而在骨髓特异蛋白OCN和OSX的表达上，虽然仍高于其他两组，但差异无统计学意义P＞0.05。此外，B、C两组与阴阳两个对照组相比，以上四种蛋白的表达水平均出现了较为明显的变化，如:sceleraxis，MEPE的表达均高于阴性对照组，但还达不到阳性对照组的水平，而OCN和OSX的表达均高于两个对照组，尤其是OSX与阳性对照组相比有更为显著的差别，P＜0.01。但B、C两组之间各蛋白的表达均未出现统计学差异，P＞0.05。　　结论:联合培养可促进骨髓间充质干细胞获得部分牙周膜干细胞的特性，且少量的牙周膜干细胞同样可以促进骨髓间充质干细胞获得牙源性干细胞特性。　　第三部分，小型猪自体骨髓间充质干细胞应用于全脱位牙延迟再植治疗的体内研究　　目的:在体内研究诱导自体骨髓间充质干细胞在牙延迟再植治疗中再生牙周复合体的作用，探索适合临床实际操作的全脱位牙牙周组织再生技术。　　方法:选择6只3-4月龄四川达硕小型猪的60颗牙齿为研究对象。实验前2周，准备P3自体impBM-MSCs（P∶M=1∶10共培养14天），mpBM-MSCs和mpPDLSCs。术前并将各类细胞调整至2×107个/ml备用，手术建立全脱位牙模型，将拔除的受试牙至于体外干燥环境中滞留1h，并在回植前，刮除牙根表面牙周膜组织。根据回植细胞种类，将其划分为4组:A组:空白对照组，直接将牙根表面处理后回植至牙槽窝;B组:mpBM-MSCs回植组;C组:impBM-MSCs回植组;D组:mpPDLSCs回植组。术后6w检测牙周再生相关临床和影像学指标，制作组织学切片观察牙周再生组织结构，并应用Realtime-PCR检测牙周组织特意蛋白COLI，Scleraxis，MEPE和DSPP等蛋白相对mRNA表达水平，了解各组牙周再生能力。　　结果:成功建立牙齿全脱位模型。术后6w对各组受试牙齿的临床检测发现，经过三类细胞介导的牙齿延迟再植治疗组与空白对照组相比，PD，GR，Al，BI指数均较低，基本可以达到术前水平。空白组GR出现负值，说明牙龈出现退缩。在牙齿松动度的检测上，空白对照组与另外3组相比，仍有近3度的松动，而3个实验组松动度基本恢复到术前标准。影像学检测结果显示，空白对照组出现了常见的牙再植术术后并发症-牙根外吸收，较为严重的出现了病理性骨折，而经过细胞介导的牙再植治疗，牙齿几乎没有出现以上并发症，但部分牙齿的局部出现浅表性吸收，但范围较小。组织学切片观察显示，经过细胞介导的实验组均出现了牙周膜组织再生，在切片中可以清晰辨认牙周韧带，Sharp穿通纤维和血管等解剖学结构，而空白对照组仅在牙根局部发现少量的正常牙周膜组织，大部分牙周组织结构破坏，牙根外吸收是主要的病理学改变。在牙周组织特意蛋白DSPP和COLI的表达上，B组较C、D两组低，但差异无统计学意义。在其它两个蛋白的比较中，三组表达水平相似，也无统计学差异，P＞0.05　　结论:自体impBM-MSCs可以在移植后获得更多牙源特性，治疗效果近似PDLSCs，较直接通过自体mpBM-MSCs移植具有一定优势，但考虑临床实际可实施性，认为单独回植自体mpBM-MSCs即可获得较为理想的再植效果，它不仅能够避免异体干细胞移植的风险，同时能够降低或消除离体时间对牙再植的不良影响，在牙齿延迟再植过程中发挥了积极的作用，是解决全脱位牙延迟再植的选择之一。