研究背景：　　食管癌为临床常见癌症之一，多项研究表明STAT3信号通路参与了食管癌形成和发展，影响了其预后。健脾和胃法及其代表方六君子汤可以抑制肿瘤细胞EC9706、Eca-109的增殖，可以抑制食管癌和内皮细胞中IL-6、VEGF的分泌以及STAT3和p-STAT3表达，诱导EC9706细胞的凋亡；可以抑制食管癌细胞引起的血管生成和内皮细胞的增殖、迁移、小管形成。　　基于以上研究，本项目以EC9706细胞移植瘤裸鼠和离体培养的EC9706细胞作为实验对象，运用分子生物学试验方法研究健脾和胃法代表方六君子汤通过STAT3信号通路对食管癌细胞 EC9706以及移植瘤生长的干预作用，以期发现健脾和胃法治疗食管癌的分子机制。鉴于六君子汤方药的提取和体外有效作用部位的筛选工作已由其他实验员完成，本项目体外研究部分直接选取具有最大效价强度的乙酸乙酯提取部位作为实验药物进行研究。　　目的：　　通过观察健脾和胃法及其代表方六君子汤对裸鼠移植瘤的生长、EC9706细胞增殖以及组织（细胞）中STAT3通路相关因子和蛋白表达的影响，探讨健脾和胃法及其代表方六君子汤治疗食管癌的分子机制。　　方法：　　第一部分体内实验　　移植瘤动物模型建立：收集对数生长期的EC9706细胞，于裸鼠右胁部皮下注射0.1mL（约2×106个细胞）细胞混悬液制备裸鼠移植瘤模型。　　实验药物制备：六君子汤原方换算成小鼠给药剂量，水煎后浓缩备用。Stattic给药剂量为25mg/kg，DMSO溶解后用PBS稀释。　　分组给药：实验分为模型组（M组）、六君子汤组（L组）、抑制剂组（S组）、六君子汤加抑制剂组（ L+S组），C组灌服生理盐水腹腔注射生理盐水；L组灌服六君子汤腹腔注射生理盐水；S组灌服生理盐水腹腔注射Stattic工作液；L+S组灌服六君子汤水煎液腹腔注射Stattic工作液。灌胃（0.2mL/只次）每日1次，腹腔注射（0.2mL/只次）隔日一次。　　指标观察：隔日测量肿瘤体积，观察裸鼠生存状态，记录饮食体重变化。　　检测指标：给药4周后摘除眼球取血，脱臼处死后摘取移植瘤， ELISA检测移植瘤裸鼠血清中 IL-6、VEGF含量；免疫组化检测移植瘤组织中CD34和VEGF表达；Western blot检测移植瘤组织细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。　　第二部分体外实验　　实验一 MTT比色法检测六君子汤乙酸乙酯提取物对EC9706细胞生长的影响　　1.运用细胞培养技术和 MTT比色技术检测六君子汤乙酸乙酯提取物、Stattic、IL-6对细胞增殖的影响，计算IC35、IC50值，实验数据用于后续实验。　　2. MTT比色法检测六君子汤乙酸乙酯提取物与 Stattic联合用药对食管鳞癌EC9706细胞增殖的影响。　　3. MTT比色法对比检测先用六君子汤乙酸乙酯提取物、Stattic孵育6小时后去除含药培养基和孵育6小时后直接加入IL-6，对食管癌细胞 EC9706增殖的影响。　　实验二蛋白免疫印迹法检测六君子汤乙酸乙酯提取物对食管癌 EC9706细胞STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响　　结果：　　第一部分体内实验　　1.六君子汤组移植瘤体积与模型组比较，六君子汤组移植瘤体积小于模型组（P＜0.05）。各用药组肿瘤重量与模型组比较，各实验组移植瘤重量均小于模型组（P＜0.05）。　　2.各实验组移植瘤裸鼠血清中 IL-6含量与模型组比较，抑制剂组低于模型组（P＜0.05），六君子汤组低于模型组（P＞0.05）。　　3.各实验组移植瘤组织中 CD34表达与模型组比较，均低于模型组（ P＜0.05）；六君子汤组与抑制剂组比较，略高于抑制剂组（P＜0.05）。　　4.六君子汤对移植瘤肿瘤组织中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白影响：结果显示与模型组相比六君子汤组和抑制剂组JAK2表达下降（P＜0.05）；与抑制剂组比较六君子汤组表达降低（P＜0.05），六君子汤加抑制剂组升高（P＜0.05）。各实验组移植瘤组织中STAT3的表达与模型组相比，抑制剂组和六君子汤组表达降低（P＜0.05），与六君子汤组比较六君子汤加抑制剂组表达有所增高（P＜0.05）。各实验组移植瘤组织中p-STAT3的表达与模型组相比，抑制剂组p-STAT3表达降低（P＜0.05），与抑制剂组比较六君子汤组和六君子汤加抑制剂组p-STAT3表达升高（P＜0.05）。　　第二部分体外实验　　1.六君子汤乙酸乙酯提取物可以抑制EC9706细胞的增殖，呈量-效关系，随剂量的增大抑制率逐渐增大，IC35=34.2μg/mL、IC50=51μg/mL、 IC75=71.5μg/mL。　　2. Stattic可以抑制EC9706细胞的增殖，呈量-效关系，随着剂量的增加抑制率增大，IC35=2.37μM，IC50=2.71μM。　　3. IL-6可以促进人食管癌 EC9706细胞的增殖，无明显量效关系，浓度为10~80ng/mL的IL-6培养基组与空白对照组OD值比较，均大于空白对照组（P＜0.05）。　　4.六君子汤与 Stattic联合用药结果显示，在浓度为 IC35和IC50时两药的联合用药的CDI均值为0.423、0.175，均小于0.7。　　5.六君子汤乙酸乙酯/Stattic孵育6小时后去除含药培养基，同时加入含有IL-6的培养基，各实验组OD值与空白组比较，均大于空白组（P＜0.05），整体表现为促进细胞增殖；先用两药孵育6小时然后加入IL-6培养基，各实验组OD值与空白组比较，均小于空白组（P＜0.05），整体表现为抑制细胞增殖。　　6.35%抑制率浓度的六君子汤乙酸乙酯提取物对EC9706细胞 p-STAT3蛋白表达影响：在10min至6h时间范围内与空白对照组比较， Stattic组在30min和1h两个时间点 p-STAT3表达降低（P＜0.05），六君子汤在10min至6h范围内p-STAT3蛋白表达降低（P＜0.05），六君子汤加Stattic组在10min、30min和6h三个时间点p-STAT3表达降低（P＜0.05）；模型组（IL-6组）在10min、30min、6h时间内 p-STAT3表达升高（P＜0.05）。在与模型组（IL-6组）比较，Stattic加IL-6组在10min至1h时间内p-STAT3表达降低（P＜0.05），六君子汤加IL-6组在10min、30min和6h时间点p-STAT3表达降低（P＜0.05），六君子汤加Stattic加IL-6组在10min、30min和6h时间点p-STAT3表达降低（P＜0.05）。　　35%抑制率浓度的六君子汤乙酸乙酯提取物在10min至6h时间内六君子汤对EC9706细胞中STAT3蛋白表达的影响：与空白组比较，30min时间点Stattic组、六君子汤组、六君子汤加Stattic组STAT3蛋白表达降低（P＜0.05），IL-6组30min时间点STAT3蛋白表达降低（P＜0.05），Stattic加IL-6组在30min、1h时间点STAT3蛋白表达降低（P＜0.05），六君子汤加 IL-6在1h时间点 STAT3蛋白表达降低（P＜0.05），六君子汤加 Stattic加 IL-6在1h时间点STAT3蛋白表达降低（P＜0.05）。　　35%抑制率浓度的六君子汤乙酸乙酯提取物在10min至6h时间内六君子汤对EC9706细胞中p-STAT3蛋白占STAT3蛋白比例：与空白组比较，Stattic组在1h时间点 p-STAT3比重降低（P＜0.05）。六君子汤组在10min至6h时间范围内p-STAT3比重均降低（P＜0.05），六君子汤加Stattic组在10min、30min、6h时间点p-STAT3比重降低（P＜0.05），IL-6组在10min至6h时间点p-STAT3比重升高（P＜0.05）。与IL-6组比较，Stattic加 IL-6组在10min至1h内p-STAT3比重降低（P＜0.05），六君子汤加IL-6组在10min、30min、6h时间点p-STAT3比重降低（P＜0.05）；六君子汤加Stattic加IL-6组在10min、30min、6h时间点p-STAT3比重降低（P＜0.05）。　　结论：　　1.六君子汤可以抑制食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的生长，下调移植瘤中CD34、JAK2、STAT3的表达。　　2.六君子汤乙酸乙酯部位可以抑制EC9706细胞的增殖，可以下调EC9706细胞中STAT3蛋白表达及其磷酸化。　　3.健脾和胃法及其代表方六君子汤可以通过下调STAT3信号通路相关因子及蛋白的表达干预食管癌细胞株EC9706的生长。