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咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)作为茶叶、咖啡和可可三大软饮料植物中嘌呤碱的主体成份,一方面因具有多种生理功能而被广泛应用于医药、食品、化工等领域；另一方面长期过量摄入咖啡碱会对人体产生一定的负面影响,从而使脱(低)咖啡碱的茶叶产品受到越来越多的欢迎。目前市场上出售的咖啡碱和低咖啡碱茶产品大都采用化学合成方法制备提取,这种方法存在附加产物多和污染环境的缺点。而从茶叶和咖啡中提取或除去天然咖啡碱的方法,则提高了原料和加工成本,容易残留有害物。因此,利用基因工程,通过构建工程菌,体外生产咖啡碱具有广阔的应用前景：同时,研究咖啡碱生物合成过程中关键酶基因的生物学功能,可以实现对咖啡碱生物合成的人工调控,为低咖啡碱茶树分子育种奠定理论基础。咖啡碱的生物合成路径主要包括四步反应,具体合成路径为：黄嘌呤核苷(XR)→7-甲基黄嘌呤核苷(7mXR)→7-甲基黄嘌呤(7-MX)→可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤)→咖啡碱(Cf)。本文通过对参与咖啡碱生物合成的关键酶在大肠杆菌中进行组合表达及其功能活性分析,尝试建立利用大肠杆菌体外合成咖啡碱的研究平台；同时通过分析比较找出可能影响茶树咖啡碱合成酶催化活性的关键氨基酸位点,进行定点突变来调控可可碱和咖啡碱的合成,探索茶树咖啡碱生物合成的分子调控机制,为人工调控咖啡碱的生物合成提供理论依据。主要研究内容及结果如下：1. pMAL-CaXMT 和 pMAL-TCS1表达载体的构建及其体外表达研究根据咖啡7-黄嘌呤核苷甲基转移酶(CaXMT)和茶树咖啡碱合成酶(TCS1)基因的ORF设计两对特异性引物,以RT-PCR扩增获得CaXMT和TCS1基因片段,分别插入P MAL-c5X中,成功构建了重组表达载体pMAL-CaXMT和pMAL-TCS1对获得的融合蛋白进行体外表达研究,结果验证了CaXMT可以催化黄嘌呤核苷(XR)生成7-甲基黄嘌呤(7-MX); TCS1可以催化7-甲基黄嘌呤生成可可碱(Tb)和咖啡碱(Cf)。2.多基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1的构建及其表达研究将重组质粒pMAL-CaXMT 和 pMAL-TCS1分别经Sall/Sbfl双酶切后,通过连接反应成功构建了双基因融合表达载体pMAL-CaXMT-TCS1.分别对表达的融合蛋白进行体内和体外酶活性分析,产物经HPLC(?)口LC-MS检测,表明CaXMT和TCS1基因在大肠杆菌中组合表达,可以实现从底物XR到7-MX、可可碱和咖啡碱的转化。进一步对酶反应条件进行优化,得到最佳酶反应条件是在底物XR和SAM的终浓度分别为170和1140条件下,25℃水浴中反应4h。此时产物中咖啡碱浓度达到最大为43.87μm0l/L.3.茶树咖啡碱合成酶(TCS1)的定点突变及体外表达研究通过分析茶树咖啡碱合成酶(TCS1)与可可碱合成酶(ICS1)的蛋白质空间结构模型,找到了四个可能影响TCS1催化活性的关键位点,分别是TM1：225位精氨酸(Arg)突变为组氨酸(His)；TM2：317位缬氨酸(Val)突变为甲硫氨酸(Met)；TM3：271位苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)；TM4:272位丙氨酸(Ala)突变为脯氨酸(Pro)。同时,构建突变体重组载体,并对表达的融合蛋白进行体外活性分析,结果显示突变体TMx催化活性与野生的TCS1相比发生较大变化,其中TM1只具备N-3位甲基化活性,即只能催化7-MX合成可可碱；突变体TM2,TM3,TM4均能催化7-MX合成可可碱和咖啡碱,但催化能力有明显差异。研究结果表明,通过在大肠杆菌中组合表达CaXMT(?)口TCS1,能够实现在体外生产咖啡碱；而对TCS1进行定点突变也可以实现对可可碱和咖啡碱合成量的调控。以上结果均在大肠杆菌表达系统上,为下一步在酵母系统中实现工业化生产咖啡碱奠定了基础。