与传统单层细胞培养技术相比,三维细胞培养形成的细胞球可以更好地反应细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间以及细胞与外界微环境之间紧密而丰富的三维联系,更好地模拟天然生理环境中细胞固有代谢（如养分、氧气、代谢物等）和增殖梯度,可追踪药物或代谢物的扩散路径,是细胞研究的理想模型。而相对于动物模型来说,三维细胞球则具有应用成本低、实验周期短、可规模化制备、易于过程监测、无动物伦理问题等优点。由于其独特优势,近年来,三维细胞球培养已在细胞生物学和医学研究中获得广泛应用,成为新药筛选、疾病建模、毒理学测试、组织工程和再生医学等方面研究不可或缺的有力工具。为了实现三维细胞球的培养和应用,研究者们建立了大量的细胞球培养方法。虽然这些方法可以实现细胞球的培养,但在操作的便捷性、细胞球制备的通量、成本、均一性、稳定性和长期性上存在着一点或者多点不足。本论文针对上述现状与需求,研究和开发了几款不同的细胞球培养芯片以期实现细胞球低成本、高通量、长期培养。论文的研究工作与主要内容如下:（1）针对传统悬滴式细胞球培养方法存在的培养基更新困难的问题,设计制作了一种集成培养基供给腔阵列的悬滴式细胞球培养芯片,该芯片通过在每个悬滴上方集成培养基供给微腔,可实现悬滴式细胞球免换液长期培养,避免了培养基更新操作对细胞球的扰动和导致悬滴掉落的风险,同时,通过激光蚀刻工艺在芯片PDMS（polydimethylsioxane）材质表面实现超疏水图形化,使得悬滴粘附点与周围区域存在巨大浸润性差异,从而使得悬滴更趋于球形,促进悬滴中细胞团聚,进而形成更紧致、圆度更好的细胞球。实验结果和模拟分析均证实,该芯片解决了传统悬滴芯片在细胞球长期培养过程中换液困难的问题,实现了细胞球的免换液长期培养（30天）,而且,细胞球中有87.5%的细胞具有良好的活性,而传统悬滴不换液的细胞球在第4天就出现了大量的细胞坏死;同时,得益于较小的悬滴接触面,促使该芯片培养出了形状更规则的细胞球（圆度为0.891）,而传统方法培养的细胞球多为扁平形（圆度为0.494）。（2）针对传统悬滴式细胞球培养方法中存在的悬滴稳定性差、易掉落的问题,开发了一种坐滴式细胞球培养芯片。该芯片主体结构为一组超疏水微腔阵列,且每个微腔底部包含一个小通孔。利用其超疏水表面特征,通过液体的表面张力和重力的协同作用实现细胞液在微腔阵列中的自动快速分配和物理隔离,只需3分钟,便可完成384孔的进样操作。得益于其坐滴式培养方式,该培养模式不仅保持了悬滴式细胞球培养方法低外源基质干扰、高气氛供给优势,而且其中待培养细胞液滴具有极强的机械稳定性,避免了悬滴式培养过程中细胞球培养液滴易于掉落的问题;同时,其开放式结构特点,也使得培养基更新和细胞球撷取非常方便,特别是基于其超疏水表面特性,可实现细胞球的批量快速收集（10 s内实现近100%的回收）,大大提高了细胞球制备的效率,这些是其他培养方法无法做到的。（3）为了进一步提高细胞球培养的自动化程度,开发了一种集成培养基自动灌注功能的曲面微腔阵列式细胞球培养芯片。一方面,利用重力作用和简单的管道外设,构建了培养基自动灌注系统,可以实现1 m L/h的灌注流速;另一方面,通过简单的机械加工与焦糖回流工艺（80℃真空回流30 min）,制作出了集成灌注管道的曲面微腔阵列芯片,通过结合培养基自动灌注系统与集成管道的曲面微腔阵列芯片,可实现细胞球的自动灌注培养,与静态培养相比,灌注培养细胞球的3天存活率为98.6%,而静态培养的细胞存活率仅为5.68%（封闭芯片内）,这种简易低成本、无外源驱动的自动灌注方法,对于促进细胞球培养技术在普通实验室的广泛应用具有积极意义。（4）针对目前细胞球培养过程中细胞团聚成球慢、通量有限等不足,设计开发了一种基于表面张力作用的自乳化快速高通量细胞球培养芯片。该芯片通过细胞悬液在微腔阵列中的自乳化作用,可以在数分钟内快速形成大量的细胞聚集体,加速细胞球的培养进程。通过理论分析与计算,研究了影响自乳化效率的关键几何参数和条件,通过星形微腔的设计和表面抗粘附的处理（浸泡Pluronic F-127）,制作出了适合于高通量细胞球培养的快速自乳化星形微腔阵列芯片,实现了细胞球的快速（3 h内）大批量（约20000个）制备。综上所述,本论文针对目前细胞球培养方法中存在的不足,提出了四种方法,解决了悬滴芯片细胞球长期培养过程中换液困难的问题,实现了长达一个月的免换液培养;利用坐滴式超疏水通孔芯片实现了细胞球培养的方便快捷操作,提高了细胞球培养的稳定性;通过重力和焦糖回流形成的曲面微腔实现了细胞球的灌注培养,实现了培养基的自动更新;利用自乳化的方法实现了细胞球的快速高通量制备。本论文提出的几类细胞球培养方法,解决了目前细胞球培养的部分问题,为类器官培养等三维细胞培养提供了备选平台。