早期宫颈鳞癌淋巴结转移相关EST的筛选及全长cDNA的克隆、验证

来源 :山西医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:kxlzyc
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目的从全基因cDNA微阵列筛查出的与早期宫颈鳞癌(Squamous Cervical Carcinoma,SCC)淋巴结转移相关的表达序列标签(expressed sequence tags,EST)出发,获得与早期SCC淋巴结转移相关的新基因或功能未鉴定的已知基因;进而从基因(m RNA)水平和蛋白水平在早期SCC中的进行验证,为研究早期SCC淋巴结转移的分子机制提供线索。方法首先将基因芯片所获得的EST整理后送往NCBI的BLAST网页,分别与NR(Non-Redundant GenBank+DDBJ+PDB)和人的dbEST子库等数据库进行同源性比较,将所有的EST聚类分析,结果为已登录的同源基因和可能代表新基因的EST;而后,以EST(ADCAPE03、ADCAPB08)作为种子序列进行电子延伸,将延伸的结果及筛选出的已知基因MEG3、MIF进行生物信息学分析和克隆;最后,采用反转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCT)对ADCAPE03、SNRPN、MEG3、MIF在 Ⅰb~Ⅱa期SCC组织中进行基因水平的验证,并用免疫组织化学法(Immunohistochemistry,IHC)从蛋白水平检测MIF在宫颈鳞癌组织和SiHa细胞株中的表达。结果(1)从芯片中筛选出15条EST,其中ID为ADCAPE03的序列差异倍数为10.14,可能是新的EST片段;ID为ADCAPB08的序列差异倍数为31.58,与人15号染色体基因组序列有97%同源性,其对应的基因仍需进一步分析;GenBank ID为AI140221的序列与人母系表达基因(maternally expressed gene 3,MEG3)mRNA之间的吻合度达97%;AI870661与巨噬细胞迁移抑制因子有95%的同源性。 (2)对ADCAPE03电子拼接后的序列定位于11q13-14之间,与人转录组数据库中编号为DT.311034的序列有同源性,但是该序列仍无详细的注解,无具体的基因名称,也无相应的蛋白序列;ADCAPB08电子延伸后序列经检索Unigene数据库,ADCAPB08选择相似性蛋白是“Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide N(SNRPN)。(3)经RT-PCR实验验证,SNRPN在有转移的早期SCC中的表达均显著高于其在无转移的早期SCC中的表达(P<0.01,P<0.05);而MEG3在无转移的早期SCC中的表达显著高于有转移早期SCC宫颈癌组织(P<0.01)。MIF的RT-PCR、IHC结果经统计学分析,其在早期SCC中的表达显著高于在正常宫颈组织中的表达;且在有转移的早期SCC中的表达高于在无转移的早期SCC中的表达(P<0.01,P<0.05);MIF蛋白在宫颈鳞癌SiHa细胞株的胞浆也有表达。结论发现与早期宫颈癌淋巴结转移相关的一个EST片段,序列号暂定为ADCAPE03:另外还第一次发现并检测了SNRPN、MEG3、MIF在宫颈鳞癌中的表达。其中SNRPN的mRNA表达在有转移的早期SCC中的表达显著升高;而MEG3 mRNA表达水平在无转移的早期SCC中的表达显著高于有转移的早期SCC,猜测该因子可能是一个肿瘤抑制基因;MIF无论蛋白表达还是mRNA表达水平,其在有转移的早期SCC中的表达显著高于无转移的早期SCC,且其表达与宫颈癌的淋巴结转移相关。对这些因子的进一步研究将有利于早期宫颈癌淋巴结转移分子机制的研究。
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