刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是细胞内寄生原虫,能感染多种有核细胞,全世界约有三分之一的人口隐性感染弓形虫。弓形虫感染人体后,在免疫正常人群可由急性感染快速地转为隐性感染,因而危害不明显；而在免疫抑制患者体内会广泛散播,寄生于有核细胞引起炎症,弓形虫主要损害脑、眼和淋巴结,甚至会引起死亡；在孕妇感染后,弓形虫可通过胎盘传播给胎儿,造成流产、死产、死胎、畸胎或新生儿弓形虫病。人类感染弓形虫的途径主要是通过误食未煮熟的中间宿主的肉或被终宿主(猫)排泄的卵囊污染的食物。弓形虫感染宿主后会刺激机体产生免疫反应以抵抗弓形虫感染,在感染早期,细胞免疫反应在机体内发挥主要抗感染作用。免疫的形成虽可有效地限制感染的发展和新损伤的形成,但一般并不能消除弓形虫感染。多数研究者认为,弓形虫具有带虫免疫的特点。机体只在感染过程中才对再感染具有一定程度的抵抗力,而虫体清除后该种免疫力也消失。弓形虫可以在机体免疫反应环境中保持存活,主要是通过在弓形虫纳虫泡内保持良好增殖和干扰宿主细胞信号转导的方式进行的,但宿主免疫反应只能被部分削弱,而不是完全被消除。弓形虫通过在诱导和抑制宿主免疫反应过程中保持着精致平衡,来保证在宿主细胞内寄生、增殖并有机会传播。弓形虫入侵和寄生过程中有许多宿主细胞信号通路的参与并出现广泛变化,在弓形虫入侵、寄生、增殖及与弓形虫-宿主细胞相互关系中起着重要的作用。弓形虫感染宿主细胞的机制已被广泛研究,在弓形虫入侵时,速殖子是弓形虫的主要致病虫期,其在细胞内寄生和迅速繁殖破坏宿主细胞,逸出后的裂殖子又侵袭邻近的细胞,如此反复,刺激淋巴细胞、巨噬细胞的浸润,导致组织的急性炎症和坏死。弓形虫侵入细胞的过程依次为：附着于宿主细胞；伸出类锥体；进入宿主细胞；虫体向后移动的运动连接(moving junction, MJ)形成；微线体的分泌作用；棒状体的分泌作用；虫体滑入纳虫空泡,在10s内完成整个侵入过程,虫体进入胞浆后运动较为缓慢,并且有向核移动的特性。在弓形虫侵入宿主细胞过程中会形成纳虫泡(parasitophorous vacuole, PV),在这个过程中,MJ会清除宿主细胞的一些组分(如跨膜蛋白),同时保留大部分的宿主细胞膜组分组成到纳虫泡膜(parasitophorous vacuole membrane, PVM)上,此外因宿主细胞膜中能与溶酶体和内涵体融合的组分已被MJ过滤掉,使PV成为一个非融合小室,有助于其内的速殖子抵抗宿主细胞内含体的融合及溶酶体的酸化作用。GTP酶(GTPase)是能够与三磷酸鸟苷(guanine triphosphate, GTP)结合并在Mg2+作用下将其水解为二磷酸鸟苷(guanine diphosphate, GDP)的超蛋白家族。小分子GTP酶是相对分子质量为20kDa-40kDa的单体调控性GTP酶,至少由5个家族组成,分别是:Ras、Rho、Rab、Sar1/Arf和Ran。目前研究较多的为Ras和Rho家族。其中Rho族蛋白主要包括Rho、Rac和Cdc42三个亚家族,这些蛋白最主要的功能是调节细胞骨架和肌动蛋白重组,其他功能包括调控基因转录、细胞周期和膜泡运输等。Rho GTP酶最主要的功能是调节肌动蛋白和细胞骨架的重组,从而调节细胞的形态变化和运动。该族蛋白的活化能促使细胞外基质的降解、破坏上皮层的结构和增加细胞的运动性。Rho族蛋白的活化和失活在真核细胞的许多基础性生命活动中都起着关键的作用。弓形虫入侵宿主细胞的过程伴随着宿主细胞结构的重组,包括宿主细胞中心粒及高尔基复合体定位在纳虫泡上,线粒体、微管及溶酶体被纳入了纳虫泡的边缘。弓形虫感染宿主细胞时,宿主细胞由干扰素诱导产生的GTP酶(IFN-y-Inducible GTPase6, Irga6)和小分子GTP酶ARF6可聚集在弓形虫PVM上,Irga6可以抵抗小鼠被弓形虫感染,Irga6在未感染的细胞内主要是以GDP非活化结合状态存在,但当弓形虫感染细胞后Irga6会聚集在PVM上并且转化为GTP活化状态存在,Irga6的这种聚集最终导致PVM的破裂。ARF6通过激活PI3K、PIP2和PIP3一起参与纳虫泡的形成,并且是通过聚集在PVM上起重要作用的。GTP酶在弓形虫入侵宿主过程中起所起的重要作用促使我们进一步去探讨,是否其它小分子GTP酶也同样参与了弓形虫感染宿主细胞的过程。目的：1.分析在弓形虫感染宿主细胞时,宿主细胞的RhoA和Racl GTP酶是否组成到弓形虫的PVM上。2.了解RhoA和Rac1GTP酶负显性突变体是否组成到弓形虫的PVM上。3.分析弓形虫速殖子感染后宿主细胞内源性RhoA和Rac1GTP酶的活化状态。4.探讨RhoA GTP酶在弓形虫PVM上聚集时哪些结构域是必须的。5.分析聚集在PVM上的RhoA和Rac1GTP酶的活性状态是否依赖其本身的GTP酶活性。6.探讨细胞RhoA和Rac1GTP酶的缺失是否影响弓形虫速殖子入侵宿主细胞效率。方法：1.转染pECFP-RhoA-WT和pECFP-Rac1-WT质粒于COS-7细胞,48hr后细胞分别用弓形虫RH株和Pru株速殖子侵染2hr,4%多聚甲醛固定细胞30min后,用DAPI室温下染色10mmin,荧光显微镜下观察CFP标签的RhoA和Rac1是否被组成到纳虫泡膜上。2.弓形虫RH速殖子感染16HBE细胞后,用间接免疫荧光法对内源性RhoA和Rac1进行定位。3.弓形虫速殖子感染转染了pECFP-RhoA-WT于COS-7细胞后,在感染5min后用共聚焦显微法每10min实时观察宿主细胞RhoA GTP酶在PVM上的聚集情况。4.分别转染RhoA和Racl负显性突变体(pECFP-RhoA-N19和pECFP-Racl-N17)于COS-7细胞中,48hr后用速殖子侵染2hr,4%多聚甲醛固定细胞30mmin后,用DAPI室温下染色10min,荧光显微镜下观察非活化的RhoA和Rac1是否会聚集在纳虫泡膜上。5.16HBE细胞用RH株速殖子感染后收集细胞,用RIPA试剂裂解,120ug总蛋白用于Rho GST pull down,检测弓形虫入侵是否激活RhoA和Rac1GTP酶。6.以pECFP-RhoA-WT为亲本质粒,构建RhoA每10个氨基酸缺失的突变体19个即M1-M19。将M1-M19转化入COS-7细胞,48hr后用RH株速殖子侵染2hr,4%多聚甲醛固定细胞30min后,用DAPI室温下染色10min,荧光显微镜下观察各突变体RhoA在纳虫泡膜上的聚集情况。7.COS-7细胞转染pECFP-RhoA-WT后速殖子侵染2hr,100nM EGF加于六孔板一角,激活5min后用多聚甲醛固定细胞,DAPI室温下染色,荧光显微镜下观察RhoA的转位情况。8.宿主细胞RhoA和Racl的活性及存在与弓形虫感染率关系的研究：a.正常COS-7细胞COS-7细胞分别转染pECFP-RhoA-WI、pECFP-RhoA-N19和pECFP-Racl-WT、pECFP-Rael-N17,48hr后速殖子侵染2hr,多聚甲醛固定细胞,Giemsa染色,计算细胞感染率并进行统计学分析,比较正常细胞与转染细胞的感染率是否有统计学差异。b.正常16HBE细胞及单独转染RhoA-siRNA、Rac1-siRNA和共同RhoA-siRNA和Racl-siRNA转染组的16HBE细胞,用速殖子侵染2hr,多聚甲醛固定细胞,Giemsa染色,计算细胞感染率并进行统计学分析,比较正常细胞与转染细胞的感染率是否有统计学差异。结果：1.小分子GTP酶-RhoA和Racl在弓形虫感染宿主细胞时会在PVM上聚集。2. RhoA和Racl GTP酶在PVM上的聚集以GTP酶活性状态存在。3.弓形虫速殖子的感染可以激活宿主细胞内源性RhoA和Racl GTP酶。4. RhoA GTP酶依赖不同的RhoA结构域在弓形虫PVM上聚集。5.细胞RhoA和Racl GTP酶为弓形虫速殖子有效入侵宿主细胞所必需。结论：1.无论弓形虫弱毒株还是强毒株速殖子,宿主细胞RhoA和Racl GTP酶在弓形虫速殖子入侵时都会聚集在PVM上,而且这种聚集依赖其完整的GTP酶活性。2.弓形虫速殖子感染细胞可以激活内源性RhoA和Racl GTP酶,并且在弓形虫刚开始入侵时RhoA和Racl GTP酶就会在PVM上聚集,聚集的RhoA和Racl GTP酶来自细胞膜或者细胞质。3.决定RhoA在PVM上聚集的结构域有:GTP/Mg2+结合位点、Mdia效应器作用位点、G1box、G2box和G5box。4.表皮生长因子(EGF)刺激感染的宿主细胞后,RhoA和Racl GTP酶在PVM上并没有发生移位现象,这显示RhoA和Racl可能以GTP活化形式存在于PVM上。5.细胞过表达pECFP-RhoA-WT、pECFP-Rac1-WT、pECFP-RhoA-N19、 pECFP-Racl-N17和将细胞内RhoA和Racl GTP酶基因沉默后对细胞感染率的统计数据显示RhoA和Racl GTP酶为弓形虫有效入侵所必需,RhoA和Racl GTP酶在PVM上聚集及其必须的生物活性都显示RhoA和Racl GTP酶参与并作用于弓形虫速殖子感染宿主细胞这一过程。