过敏毒素C5a是补体系统级联活化过程中产生的一个小片段蛋白,释放到血液中,具有免疫调节作用。同时,C5a也是重要的前炎症性介质,与炎症反应的发生、发展密切相关。C5aR广泛分布在髓样细胞表面,C5a与细胞表面C5aR结合,释放组织胺、血管活化因子、自由基及白细胞介素IL-6、IL-8等,导致平滑肌收缩、血管通透性增加。此外,高浓度的C5a是中性粒细胞、嗜酸粒细胞和单核细胞的趋化剂,可诱导细胞顺浓度梯度方向移动。机体出现炎症时,血液中的C5a浓度增加,引起PMN在血管内皮位置聚集,进而穿过内皮向组织浸润,诱导产生并释放大量的炎症介质,导致血管内功能不全,使炎症加重。研究证实过敏毒素C5a在机体许多疾病的病理过程中参与炎症的发生和发展,所以研究炎症介质C5a不仅对揭示炎症反应过程中的分子机制有重要的意义,而且对于寻求、开发有效的C5a拮抗剂控制其在免疫应答和炎症反应等病理过程中的作用,对于多种炎性疾病的治疗和转归具有重大临床价值,而研发猪C5a适配体拮抗剂作为新型养殖动物广谱抗炎药在兽医领域同样具有重大影响。诸多研究者意识到用阻断C5a与其受体(C5aR/CD88)结合的方法抑制炎症反应是极具临床应用前景的抗炎新途径,然而抗体类抑制剂制备难度大、成本高、反复使用容易使机体出现过敏反应等,探索与抗C5a抗体作用原理相似,而且更加便宜、安全、活性稳定的拮抗剂成为抗炎新思路。适配体是一类能特异性地与各类生物靶标以高亲和力相结合的单链DNA或RNA,作用原理类似于抗体,通过两者结合从而抑制受体靶标的生物活性,另外适配体易制备易修饰的独特优势可弥补C5a抗体在临床治疗上的缺陷,适配体最大的优点是没有免疫原性,故在临床用药时能重复使用;随着适配体在医学,生命科学等领域的研究和在疾病的诊断与治疗上的应用,拮抗C5a活性适配体的筛选也成为了研究的热点,因此,为了开发探索猪炎症性疾病新型广谱治疗药物,筛选猪C5a的核酸适配体是非常有必要的。本论文采用毛细管电泳筛选策略,以猪C5a为靶标进行单链DNA适配体的筛选;并且对筛选得到的适配体的亲和力和拮抗活性进行了考察。研究内容主要包括:(1)原核表达猪C5a蛋白。试验内容:(1)将猪C5a蛋白基因分别克隆入pET32a和pET28a表达载体中,构建重组质粒p ET32a-C5a和pET28a-C5a,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,挑取单菌落,提取重组质粒,进行一系列鉴定;(2)以sds-page及westernblotting等方法鉴定重组质粒是否成功表达猪c5a蛋白。(3)将鉴定正确的菌株大量培养,进行iptg诱导表达。(4)利用铜柱亲和层析技术纯化含有组氨酸标签的目的蛋白。(5)利用猪中性粒细胞趋化及诱导试验鉴定目的蛋白的生物活性。(2)猪c5a的单链dna适配体筛选和评价。(1)将具有生物活性的重组猪c5a蛋白作为靶标,选用基于ce的高效分离能力的ce-selex技术,将未结合序列与结合复合物分离,经过六轮筛选,最终获得能与该蛋白具有较高结合力的dna适配体序列组。(2)以高通量测序和生物信息学技术进行候选适配体的结构解析;(3)通过emsa和spr技术测定适配体与c5a蛋白结合的亲和力和特异性;(4)最后利用体外细胞趋化试验和流式细胞技术检测适配体s1拮抗猪c5a生物活性的能力。通过上述两大部分试验,获得了以下结果:(1)成功构建了pet32a-c5a和pet28a-c5a两株重组表达质粒,转染大肠杆菌bl21后优化其诱导条件,成功获得了大量表达猪c5a蛋白的菌株,通过铜柱亲和层析纯化蛋白,sds-page和western-blotting检测分析表明,重组猪c5a蛋白获得表达,重组蛋白大小为10,000,纯化后猪c5a蛋白经质谱鉴定,其一级结构正确,纯度达到90%以上,浓度为2.5g/l。体外细胞试验检测到c5a具有趋化和诱导中性粒细胞的活性,为下一步大量纯化猪c5a蛋白用于适配体筛选奠定了基础。(2)猪c5a单链dna适配体的筛选结果显示,经过六轮筛选,从毛细管电泳峰图上可以看出靶标蛋白与核酸复合物峰图,候选序列高通量测序获得55000多条序列,序列统计比对分析后挑选出的六条代表序列与c5a亲和力测定,适配体s1显示出高亲和力和结合特异性,kd值为4.81μm。通过体外中性粒细胞趋化试验,发现适配体s1和s2均可以抑制猪c5a的趋化活性,流式细胞试验结果得出适配体s1能够抑制c5a与猪中性粒细胞表面c5ar的结合,从而抑制其活性作用。通过以上结果,得出如下4条结论:(1)成功构建了pet32a-c5a和pet28a-c5a两株猪c5a蛋白基因的原核表达系统,纯化获得的猪c5a蛋白经质谱鉴定,其一级结构正确,体外细胞试验证明其具有生物活性,为下一步适配体筛选奠定了基础。(2)建立了筛选猪c5a核酸适配体的高效筛选条件;ce-selex技术结合高通量测序和spr技术,针对猪c5a蛋白快速高效的筛选到特异性结合的适配体。(3)初步建立适配体高通量测序大数据的分析流程,不仅提高了筛选效率,而且避免了传统lts单点测序,可能错失更优适配体的缺点。本试验通过序列分析软件,将大数据统计分类,更有目标性的挑选候选适配体。(4)体外细胞趋化试验中,适配体S1和S2均可有效抑制C5a诱导的猪中性粒细胞的趋化,拮抗能力相比,S1比S2强,更有治疗猪C5a介导的炎性疾病的潜力。论文创新点:1.首次通过原核表达获得有活性的猪C5a蛋白,在兽医领域为深入研究C5a致炎机理奠定基础,同时为其拮抗剂的研发提供条件。2.建立了毛细管筛选技术,用于猪C5a适配体的高效筛选,并获得了能够体外拮抗C5a生物活性的适配体S1,为开发猪适配体类广谱抗炎药物提供了可能性。