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随着干细胞研究领域的飞速发展和实验技术的进步,“肿瘤干细胞”理论再次引起人们的关注,并为越来越多的学者所接受。该理论认为:肿瘤是一个异质性的群体,只有肿瘤干细胞亚群具备自我更新、多向分化以及成瘤能力,而非肿瘤干细胞(包括祖细胞、分化的肿瘤细胞)则缺乏这些能力。研究者先后在白血病、乳腺癌、脑肿瘤、结肠癌、肝癌、前列腺癌等至少20类肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在,并对其多种重要的生物学特性进行了细致的观察,包括治疗抵抗性、促血管生成能力、侵袭特性、免疫源性等。随着研究的深入,越来越多的研究者相信,这群数量稀少、性质特殊的细胞,才是恶性肿瘤发生、进展以及治疗后复发的根源,而探索针对肿瘤干细胞亚群的靶向治疗措施,是今后恶性肿瘤治疗的重要方向之一。趋化因子受体CXCR4属于7次跨膜的G蛋白偶联受体家族,可被其特异性配体SDF-1激活。CXCR4在多种肿瘤中都具有很强的促侵袭和促血管生成能力。在胶质瘤中,CXCR4的表达与肿瘤的级别呈正相关,其活化后可促进胶质瘤细胞侵袭,并且活化后还可以通过上调胶质瘤细胞VEGF的分泌量来促进肿瘤的血管生成。近期的研究表明,从原代胶质瘤标本中获取的胶质瘤干细胞高表达CXCR4。然而CXCR4在胶质瘤干细胞中的作用尚需进一步研究。在本研究中,首先,采用间接免疫荧光标记验证U87细胞及其颅内移植瘤标本中胶质瘤干细胞标记物CD133是否和CXCR4共表达。然后,我们采用si-RNA(小干扰RNA)下调U87细胞中CXCR4的表达,并且分别从稳定转染CXCR4小干扰RNA质粒的U87细胞和稳定转染阴性对照质粒的U87细胞中培养出胶质瘤干细胞球,并对其进行鉴定,同时观察两者CXCR4的表达情况。在此基础上我们进一步通过Transwell小室比较两者的侵袭能力;采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测两者细胞培养上清内VEGF的含量。我们还采用上述胶质瘤干细胞的裸鼠颅内移植瘤,在体内观察其VEGF的分泌的情况和肿瘤的微血管密度的差别。主要的结果和结论如下:1. U87细胞中胶质瘤干细胞的CXCR4表达情况用免疫荧光标记U87细胞及其瘤颅内移植瘤标本,激光共聚焦扫描显微镜观察CXCR4和CD133的表达情况。结果显示,U87细胞及其建立的颅内移植瘤中均可以检测到CD133和CXCR4双阳性的胶质瘤干细胞2.获取稳定转染CXCR4干扰质粒的U87细胞获取稳定转染的细胞后,我们对干扰效果进行检测了检测。Western blot结果显示,干扰组1细胞的CXCR4表达水平下降较明显;干扰组2略有下降;而干扰组3则几乎没有效果。我们选用干扰组1进行后续试验,并用RT-PCR对其干扰效果从RNA水平进行了进一步的检验,结果表明干扰组CXCR4水平显著下降。3.胶质瘤干细胞球的筛选和鉴定(1)用逐渐添加神经干细胞条件培养基的方法,成功地分别从干扰组与对照组U87细胞中培养出胶质瘤干细胞球。在干细胞培养基中,分化的肿瘤细胞贴壁并且生长受到抑制,而GSCs能够在培养基中呈克隆球样悬浮生长。(2)两组胶质瘤干细胞球均表达胶质瘤干细胞的标记物CD133和nestin,并且从干扰组U87细胞中获得的胶质瘤干细胞球,其CXCR4的表达较对照组明显降低。4.下调CXCR4表达对胶质瘤干细胞趋化和侵袭能力的影响(1)下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后,体外趋化结果显示,干扰组的胶质瘤干细胞转移至微孔膜下表面的细胞数明显少于对照组。在每个高倍镜视野下,干扰组仅有60±7.3个细胞穿过微孔转移至膜的下方,对照组却有166±11.2个细胞转移至膜的下方(P<0.05)。(2)体外侵袭试验结果显示,干扰组的胶质瘤干细胞转移至微孔膜下表面的细胞数也少于对照组。干扰组为:17±5.8个/HPF,对照组为:71±8.7个/HPF(P <0.05)。5.下调CXCR4表达抑制胶质瘤干细胞分泌VEGF(1)分别在24 h、48 h时用ELISA检测各组胶质瘤干细胞培养上清中VEGF的含量。结果显示,下调胶质瘤干细胞CXCR4表达后,其VEGF的分泌量也随之降低。在24 h时干扰组和对照组VEGF的分泌量分别为690±24 pg/ml和850±25 pg/ml(P <0.05),在48 h时干扰组和对照组VEGF的分泌量分别为1504±53 pg/ml和2001±150 pg/ml(P <0.05)。(2)我们在进一步在体内对其进行验证。结果显示:干扰组胶质瘤干细胞建立的颅内移植瘤的微血管密度和VEGF的分泌量均小于对照组。综上所述,U87细胞中的胶质瘤干细胞上表达CXCR4,从干扰的U87细胞中可以培养出胶质瘤干细胞,它们也表达胶质瘤干细胞的标记物,而且从干扰组中培养出的胶质瘤干细胞的CXCR4表达水平要低于对照组;此外,干扰组的胶质瘤干细胞的趋化和侵袭能力下降,同时其分泌VEGF的能力也低于对照组,并且干扰组胶质瘤干细胞建立的裸鼠颅内移植瘤模型中微血管密度和VEGF的分泌量也低于对照组。结果提示下调胶质瘤干细胞的CXCR4表达可以抑制胶质瘤干细胞的趋化和侵袭,并且可以下调其促血管生成能力。提示:CXCR4可能是胶质瘤干细胞的一个重要治疗靶点