背景冠心病(CAD)作为威胁人类生命和健康最主要的疾病,其针对性的诊断和治疗手段在不断的更新。冠心病的防治逐渐从二级预防向一级预防的前沿推进,诊治手段也逐渐从评价和控制危险因素,向分子遗传学水平进展。目前随着分子遗传学技术的快速进展,通过连锁分析和关联研究越来越多与CAD相关的易感或致病基因被相继发现。肌细胞增强因子2A (MEF2A)是目前得到高度重视的冠心病相关基因,许多胞内信号途径可调节其活性。MEF2A在多条信号通路与负责细胞分裂、分化及死亡的基因的连接过程中起到至关重要的作用,是与肌细胞发育、血管发生密切相关的重要转录因子。2003年Wang等对美国冠心病家系的研究首次发现MEF2A第11外显子的突变是以常染色体显性形式发挥作用的CAD致病基因,其突变可能导致血管内皮和平滑肌等正常组织功能发生异常而引起CAD的发生和发展。其后Li J等人的研究均进一步证实了MEF2A的第11外显子存在其它变异区即CAG重复序列,并可能和冠心病相关,因此明确MEF2A该序列的突变可能导致的相应功能改变对探讨冠心病的发病原因具有重要意义。目前的研究主要集中在MEF2A基因突变和冠心病的相关性上,而如果能进一步阐明已知促冠心病发生的重要危险因素及相应干预措施对MEF2A转录活性的影响,以及MEF2A突变对体外培养的血管内皮及平滑肌细胞功能的影响,便可能更加明确MEF2A的生物学活性及在CAD发病中的作用,进一步对冠心病的发病机制有所补充,甚至从根本上对冠心病的病理生理过程提供新的基础性认识,最终对具有CAD高危遗传因素个体的早期诊断与筛查有重要的指导意义。目的1.观察pEGFP-N1/MEF2A真核表达重组质粒的转染效率及细胞毒性,评价脂质体法建立瞬时转染和稳定表达细胞系的可行性。2.构建MEF2A野生型及突变型四环素可诱导的重组真核表达载体,并进一步在HUVEC及VSMC细胞中研究MEF2A突变型在CAD发生中的作用。3.观察pLenti6.3-EGFP慢病毒载体转染HUVEC及VSMC细胞的效率和毒性作用,以及病毒转染对VSMC细胞迁移能力的影响,从而评价通过将MEF2A-pLenti6.3-EGFP慢病毒重组载体转染靶细胞研究MEF2A突变对细胞结构及功能影响的可行性。4.从体外细胞学水平研究ox-LDL刺激以及阿托伐他汀联合ox-LDL刺激对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中MEF2A转录水平的影响。5.通过对组织标本染色结果进行分析,得出人体内心肌及大中血管在正常状态与病理状态下MEF2A的分布及表达情况。方法1.体外培养HUVEC及VSMC细胞,应用脂质体法研究使pEGFP-N1/MEF2A真核表达重组质粒成功表达的最佳转染条件,使用倒置荧光显微镜在转染后不同时间点观察转染效率和毒性,并结合细胞免疫化学染色观察所表达的MEF2A蛋白分布及核定位情况。2.将四环素可诱导型真核表达载体系统pcDNA4.1/TO、pcDNA6.0/TO导入感受态细胞进行扩增,对pEGFP-N1-MEF2A质粒行Xho Ⅰ、XbaⅠ双酶切,期望将酶切下来的MEF2A-EGFP融合基因片断插入pcDNA4.0/TO上的多克隆位点,从而构建pcDNA4.0/TO-MEF2A四环素可诱导的重组真核细胞表达载体。3.使用pLenti6.3-EGFP重组慢病毒载体感染HUVEC及VSMC细胞,倒置荧光显微镜观察病毒转染的效率并初步评价其毒性作用,使用Blasticidin筛选稳定转染株并确定最佳筛选浓度,通过Transwell小室法判断病毒转染对VSMC细胞迁移能力的影响。4.采用体外分离培养HUVEC的方法,以oxLDL或联合阿托伐他汀刺激细胞,设计不同的刺激浓度梯度和刺激时间,通过Real—time PCR分析MEF2A转录水平的变化。5.从接受心脏移植的早发冠心病患者的心脏上取材含有粥样斑块的冠状动脉、主动脉、室壁瘤处的心肌及相对正常的心耳标本,从术中供体心脏上取材正常的主动脉对照标本。对其分别行HE普通染色、MEF2A特异的免疫荧光组化染色及免疫酶组化染色,显微镜下观察并拍照。结果1.脂质体方法可以用于体外培养的HUVEC和VSMC的转染试验,但其转染效率偏低。2. pEGFP-N1/MEF2A真核表达重组质粒在HUVEC和VSMC中无法高效表达,需要进一步改进为含诱导型启动子的真核表达载体。3. MEF2A可在体外培养的HUVEC和VSMC中广泛表达,并且主要存在于细胞核及其附近的胞质中。4.尝试构建pcDNA4.0/TO-MEF2A四环素可诱导的重组真核细胞表达载体,但pEGFP-N1-MEF2A质粒行Xho Ⅰ、XbaⅠ双酶切时速度过慢。5.采用EGFP重组慢病毒载体pLenti6.3-EGFP感染HUVEC及VSMC细胞,感染效率可分别达到70-80%及50-60%；感染后可通过绿色荧光蛋白(EGFP)判断目的基因的表达；EGFP在细胞消化传代后仍可稳定表达。6.细胞转染pLenti6.3-EGFP后可经过Blasticidin筛选稳定转染株,Blasticidin的最佳筛选浓度为8mg/ml。7.病毒转染不会导致HUVEC及VSMC细胞出现明显的毒性作用,并且不会对VSMC迁移能力产生明显影响。8. ox-LDL呈剂量及时间依赖性下调MEF2A mRNA的表达。9.固定ox-LDL的刺激浓度为100μg/mL,各时间点MEF2A的表达均随阿托伐他汀浓度的升高而降低,30μmol/L浓度时MEF2A下降最明显。10.阿托伐他汀浓度为1μmol/L时,MEF2A的相对表达量与时间关系不明显；而当阿托伐他汀浓度为10或30pmol/L时,MEF2A的相对表达可随时间延长而升高。11.早发冠心病患者斑块处冠状动脉与正常主动脉相比、患者的主动脉与正常心脏供体的主动脉相比,患者室壁瘤处的心肌与其相对正常的心耳处心肌相比,MEF2A的表达水平均偏低。12.免疫荧光法组化染色结果与免疫酶法组化染色结果一致。结论1、MEF2A在体外培养的HUVEC和VSMC细胞中广泛表达并主要存在于细胞核及其附近的胞质中。但应用脂质体法对两种细胞转染pEGFP-N1/MEF2A真核表达重组质粒后,并不能使外源的MEF2A蛋白在HUVEC和VSMC细胞中高效表达。2、可以尝试构建MEF2A四环素可诱导型真核细胞表达载体,使外源插入的MEF2A基因在HUVEC及VSMC中顺利、高效且受四环素调控地进行表达。3、采用EGFP重组慢病毒载体感染HUVEC及VSMC细胞可以达到很高的转染效率,病毒转染不会导致靶细胞出现明显的毒性作用,并且不会对VSMC迁移能力产生明显影响。将来可以构建MEF2A-EGFP重组慢病毒载体,并在HUVEC及VSMC细胞中研究不同MEF2A突变型与冠心病发病的关系。4、通过体外细胞学实验,证实冠心病相关的危险因素之一的oxLDL呈剂量及时间依赖性下调MEF2A mRNA的表达,采用阿托伐他汀干预会进一步增加该作用。5、通过对早发冠心病患者心肌及大中动脉免疫荧光及免疫酶组织化学染色,证实人体内心肌在缺血损伤的病理状态下,大中动脉在粥样硬化的病理状态下MEF2A表达水平会下调,该结果与体外细胞学实验所得结果一致。