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目的:
构建JEVC蛋白编码基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞有无毒性及对酵母细胞内报告基因有无自激活效应,为筛选及验证JEVC蛋白相互作用相关蛋白奠定实验基础。
材料与方法:
一、实验材料
1、质粒、载体、菌株、细胞
质粒pMD-JC由本实验室构建保存,所选表达载体pMD19-Tsimple购自TaKaRa公司;大肠杆菌感受态细胞E.coliCompetentCellsJM109购自TaKaRa公司,用于重组质粒构建、转化;酵母菌Y2HGold及载体pGBKT7、pGADT7、pGADT7-T、pGBKT7-53、pGBKT7-Lam购自Clontech公司,用于酵母双杂交实验。
2、主要试剂
PCR用DNA聚合酶(CodeNo.DR010S)、质粒小剂量提取试剂盒(CodeNo.DV801A)、琼脂糖凝胶DNA纯化试剂盒(CodeNo.DV805A)、酶促反应DNA片断纯化试剂盒(CodeNo.DV807A)、DNAT4连接酶(CodeNo.DR6023)、限制性内切酶EcoRI/BamHI等均购自TaKaRa公司,用于重组质粒构建与鉴定;氨苄青霉素、卡那霉素购自Sigma公司,琼脂糖购自TaKaRa公司,用于质粒转化及电泳分析;酵母培养基、各种氨基酸缺陷培养基、X-α-gal、金担子素、50%聚乙二醇3350、10x醋酸锂等购自Clontech公司,用于酵母菌Y2HGold感受态细胞的制备、质粒转化酵母感受态细胞及酵母氨基酸缺陷筛选;酵母总蛋白提取试剂盒(CodeNo.D6023)购自TaKaRa公司,SDS-PAGE上样缓冲液、预染蛋白Marker、PVDF膜购自碧云天公司,一抗BD-mAb购自Clontcch公司,辣根过氧化物酶标记-羊抗鼠IgG购自Santa公司,GAPDH内参抗体购自Earthox公司,用于Western-blotting分析。
二、实验方法
1、诱饵质粒pGBKT7-JC构建、转化及鉴定。
2、PEG/LiAC法将质粒pGBKT7-JC与载体pGBKT7分别转化酵母菌株Y2HGold感受态细胞。
3、经酵母氨基酸缺陷培养及表现型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞毒性。
4、经酵母氨基酸缺陷培养及表现型筛选检测诱饵蛋白酵母细胞内报告基因自激活效应。
5、Western-blotting法检测诱饵蛋白BD-JC的表达。
实验结果:
1、诱饵质粒pGBKT7-JC构建及鉴定
重组质粒pGBKT7-JC经EcoRI/BamHI酶切后电泳分析,得到381bp与7.3kb大小的两个片段,与预期一致;测序分析JEVC蛋白编码基因与发表的序列完全相符,构建成功的诱饵质粒命名为pGBKT7-JC。
2、质粒pGBKT7-JC与载体pGBKT7分别转化酵母菌株Y2HGold感受态细胞
PEG/LiAC法将已鉴定正确的pGBKT7-JC与空载体pGBKT7分别转化酵母菌Y2HGold感受态细胞,涂布于SD/-Trp进行菌落筛选,30℃温箱孵育3～5天后两组缺陷培养基上均可见大小均匀阳性菌落生长。
3、诱饵蛋白毒性检测
观察发现SD/-Trp氨基酸缺陷培养基上已转化pGBKT7-JC与pGBKT7的酵母菌落数、菌落大小、分布无明显差异;将转化有pGBKT7-JC与pGBKT7酵母菌落接种于SD/-Trp液体培养基中振荡过夜测得OD600值分别为0.8643和0.8706,均＞0.8。
4、诱饵蛋白自激活检测
已转化pGBKT7-JC的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal缺陷培养基上可见阳性菌落生长,但菌落颜色未变蓝;而已转化pGBKT7-JC的酵母菌在SD/-Trp/X-α-gal/AbA缺陷培养基上未见菌落生长。
5、Western-blotting法检测诱饵蛋白BD-JC的表达
Western-blotting法分析,pGBKT7蛋白样品约在22KDa处出现目的条带,pGBKT7-JC蛋白样品约在35KDa处可见目的条带。
结论:
1、成功构建的酵母双杂交诱饵表达质粒pGBKT7-JC含有JEVC蛋白编码基因。
2、诱饵质粒pGBKT7-JC成功转化入酵母菌株Y2HGold感受态细胞且其表达的诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应。