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肝再生磷酸酶((P)hosphatase of(R)egenerating(L)iver，PRL)家族蛋白近年来受到广泛关注，它们在肿瘤生成、浸润、迁移中均扮演了重要角色，其中PRL-3与肿瘤转移之间的关系尤为突出。随着对PRL-3研究的深入，越来越多的证据表明PRL-3不止在结肠癌中高表达，也在许多其他恶性肿瘤中有异常增加，另外其促进肿瘤转移的信号通路及下游信号分子也不断被阐明。但迄今为止，鲜见针对PRL-3表达调控研究的报道。正常情况下，是什么转录因子调节PRL-3的转录？在肿瘤发生时它们又会受到那些因素影响从而提高了PRL-3的表达？PRL-3转录形式是否单一？如果不是，它们又受到哪些特异性调控？本论文主要就这些问题展开研究。 在第一章中，我们通过5 RACE的方法克隆了PRL-3基因的5’非翻译区(5 UTR)，将其与PRL-3基因的DNA序列进行比对，找到了其转录起始位点，位于起始密码子上游881bp处。对转录起始位点上游潜在的调控区域分析，我们初步确定了两段对PRL-3启动子活性有较大影响的区域。在第一段区域中，通过转录因子结合位点的预测、细致的克隆分析以及EMSA胶迁移阻滞实验，我们发现NFAT5结合位点对人源PRL-3启动子活性具有重要作用。但由于转录因子的转录活性一般会受到多种因素影响，我们未能严格证明NFAT5转录因子对PRL-3的转录促进作用。此外，我们发现在第二段核心区域中存在两个高度保守的MEF2结合位点，突变任意一个位点均导致PRL-3启动子活性显著下降。通过EMSA和ChIP等实验，我们证明转录因子MEF2C可以结合PRL-3启动子区域。接着在多种细胞中强制表达具有转录活性的MEF2C质粒，均可见PRL-3的mRNA表达水平显著提高。由此我们证明MEF2C是PRL-3转录的一个重要转录因子。 在第二章中，我们首先证明，VEGF可以刺激HUVECs细胞中PRL-3的转录，并且推测这可能是通过提高内源性MEF2C的表达和活性实现的。在深入研究VEGF/MEF2C/PRL-3通路之前，为了确认之前的结果，我们又从多种细胞中重新克隆了PRL-3的5UTR。经测序比对，我们不仅证实第一章结果的真实性，我们还意外发现PRL-3存在另外一种5UTR序列，提示PRL-3存在另一种转录起始方式。由于新的转录产物的起始位点更上游，我们将其定义为PRL-3-iso1;之前的转录产物我们称之为PRL-3-iso2。比较多种细胞中两种转录产物的表达水平，我们PRL-3-iso1占细胞中PRL-3的mRNA总量的主要部分，而PRL-3-iso2只在少数细胞中表达，并且表达水平较低。进一步的研究发现，MEF2C可特异性地促进PRL-3-iso2的转录，而不影响PRL-3-iso1的表达;VEGF可特异性促进HUVECs中PRL-3-iso2的转录。提示PRL-3在VEGF诱导的HUVECs细胞中具有重要功能。此外，我们通过ELISA方法发现，体外培养的结肠癌细胞SW480和SW620的培养上清中有大量VEGF存在，细胞经CoCl2处理模拟缺氧环境后，VEGF的分泌量明显增加。据此，我们猜想在肿瘤病人体内，肿瘤细胞可能会产生VEGF并分泌到血液中，从而刺激肿瘤组织附近或血液中的内皮细胞，提高其PRL-3的表达，继而提高其迁移能力，促进其浸润到肿瘤组织处，最终促进肿瘤内部的血管新生。 在第三章中，我们尝试研究PRL-3-iso1的转录调控机制。首先我们将人源和鼠源PRL-3转录调控区域序列进行比对，发现PRL-3-iso1转录起始位点上游60-30bp附近存在一段高度保守的DNA序列，提示其可能对PRL-3的转录有重要作用。构建包含和缺失该段序列的启动子报告基因，我们发现缺失该段序列后，起始位点上游区域的转录活性显著下降。用生物信息学方法对这段保守序列预测，我们发现其中存在保守的N-Myc结合位点CACGTG。可惜的是，构建了N-Myc表达载体并转染细胞后，PRL-3-iso1的转录水平并没有提高。对PRL-3-iso1的转录调控深入的研究还正在进行之中。 为了更好地研究PRL-3在肿瘤转移，血管新生，肌细胞等方面的功能，我们在第四章，构建了PRL-3的腺病毒表达载体，并证明了其比普通质粒载体的优越性，为PRL-3功能方面的研究提供了较好的分子工具。 综上所述，本论文主要研究了PRL-3的转录调控机制，首次发现了PRL-3的第一外显子，首次发现其有两种转录起始方式，并证明MEF2C可以特异性地调节其中一种的转录。发现在HUVECs细胞中存在VEGF/MEF2C/PRL-3信号通路，提示PRL-3在内皮细胞中具有重要功能，如参与肿瘤细胞的血管新生等。在以上研究的基础上，我们还初步研究了PRL-3另一转录方式的调控机制，为PRL-3以后的研究奠定了一定的理论基础;并构建了PRL-3的腺病毒表达载体，为深入研究PRL-3在血管新生、肌细胞发育中的功能提供了有力的实验工具。