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本课题应用柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠模型进行干预,观察该方 (1)对该模型大鼠水肿、蛋白尿、血浆蛋白、血脂及肾脏病理学的影响,以期进一步明确该方疗效;(2)对该模型大鼠肾组织中细胞外基质、血管紧张素Ⅱ以及抗氧化作用的的影响,探讨该方的作用途径及可能机制。本课题目的就在于通过本实验的基础研究,为行气利水(湿)清热、益气活血(化瘀)通络法用于肾病综合征的治疗提供初步的基础研究依据,亦为治疗肾病综合征提供一个有效方剂。 本文主要从以下几方面进行论述: 第一部分 柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠尿蛋白及脂质代谢的影响 目的: 观察柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠尿蛋白及脂质代谢的影响 方法: 选用健康雄性SD大鼠36只,体重为180±10g(由河北医科大学动物中心提供)。普通饲料适应性喂养1周后,分别置于代谢笼里取尿,检测24h尿蛋白和尿红细胞,结果全部为阴性。按体重随机分为正常组、模型组、柴苓归芪组、洛汀新组。正常组为6只,其他三组均为10只。模型组、洛汀新组及柴苓归芪组按5mg/kg进行尾静脉注射阿霉素,正常组注射等量生理盐水。造模一周后开始灌胃,柴苓归芪组给予柴苓归芪汤煎剂27g/kg.d,用药量为成人剂量的15倍。地龙用其提取物蚓激酶替代,用量按文献报道给予。洛汀新组给予洛汀新10mg/kg.d。正常组和模型组灌服等量生理盐水。于7周末检杀动物,心脏采血,用三氯乙酸分光光度法进行24h尿蛋白定量测定。用全自动生化分析仪检测血清尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、总蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。 结果: (1)各组大鼠24h尿蛋白定量结果显示:第2周末各组大鼠均出现不同程度的蛋白尿,但各组间无明显差异(P>0.05)。第3周末模型组与正常组比较有显著性差异(P<0.01),提示阿霉素肾病大鼠已出现明显的蛋白尿。两治疗组与模型组比较无明显差异(P>0.05)。第5周末及第7周末两治疗组大鼠24h尿蛋白定量明显低于模型组(P<0.05;P<0.01),提示柴苓归芪汤和洛汀新均可减少尿蛋白的丢失。但是两治疗组之间无明显的差异(P>0.05)。 (2)血清TP、Alb、TC、TG含量的测定结果显示:模型组TP、Alb的含量显著低于正常组(P<0.05;P<0.01),而TC、TG的含量则显著高于正常组(P<0.01);提示阿霉素肾病大鼠在第7周末存在明显的低蛋白血症和高脂血症。两个治疗组TP、Alb的含量高于模型组(P<0.01;P<0.05),而TC、TG的含量低于模型组(P<0.05;P<0.01),提示柴苓归芪汤和洛汀新均有提高血浆蛋白和降低血清TC、TG的作用。两个治疗组之间TP、Alb、TC、TG的含量无明显差异(P>0.05)。 结论: 1.柴苓归芪汤能降低尿蛋白,此作用可能是其保护肾脏,延缓肾脏疾病发展的作用机制之一。 2.柴苓归芪汤可提高血浆蛋白、改善脂质代谢紊乱、保护肾功能。 第二部分 柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠病理形态学的影响 目的: 观察柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠病理形态学的影响。 方法: 模型复制、分组和给药同第一部分。于实验的7周末,检杀动物,取各组大鼠新鲜肾组织,4%多聚甲醛溶液固定,石蜡包埋,制成2μm的石蜡切片,行光镜(HE、PAS、MASSON染色)检查,并取部分肾上极,经4%戊二醛固定和1%锇酸磷酸钠缓冲液后固定,丙酮梯度脱水,815环氧树脂包埋,LEICA UCT超薄切片机切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,日立H7500透射电镜行透射电镜检查。重点观察各组大鼠肾小球及肾小管间质病理形态学改变。 结果: (1)光镜观察结果显示:正常组肾小球及小管间质结构基本正常。模型组肾小球肿胀、充血,系膜区轻度增宽,系膜细胞增生,系膜基质增多,部分肾小球囊壁层细胞增生,少数肾小球呈现节段性硬化及球性硬化。基底膜基本正常。 (2)电镜观察结果显示:正常组肾小球上皮细胞、内皮细胞、基底膜结构均正常,上皮细胞足突结构清晰呈杵样并列排列于基底膜外侧;内皮细胞窗孔排列整齐;基底膜结构均匀完整。近曲小管刷状缘排列整齐。模型组肾小球上皮细胞足突广泛融合,足突间隙消失,上皮细胞肿胀,胞浆内空泡化,并见微绒毛变性;内皮细胞窗孔排列紊乱;基底膜结构基本正常。近曲小管腔面可见大量微绒毛,绒毛根部附近可见大量空泡变性,线粒体部分嵴融合消失。 结论: 柴苓归芪汤能减轻肾小球和肾小管的病理损害,延缓阿霉素肾病的进展。 第三部分 柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠细胞外基质(ECM)的影响 目的: 观察柴苓归芪汤对阿霉素肾病大鼠ECM的影响 方法: 模型复制、分组和给药同第一部分。于实验第七周末,检杀动物,取新鲜肾组织,4%多聚甲醛固定,常规脱水,透明,石蜡包埋,制成4um的石蜡切片,应用免疫组织化学染色方法观察各组大鼠肾组织纤维连接蛋白(FN)和层粘连蛋白(LN)的表达和分布。并采用HPIAS-1000型全自动彩色病理图象分析。 结果: 正常组FN在肾小球中有少量表达,主要分布于肾小球系膜区,基底膜上着色较浅。肾小管基底膜有极少量分布。与正常组相比,模型组在肾小球及小管中分布的范围和强度明显扩大和增强,呈高表达;与模型组相比,两治疗组表达降低,呈中度表达。半定量分析结果显示:模型组FN的相对含量及积分光密度明显高于正常组(P<0.01);两治疗组与模型组相比,其表达显著下降(P<0.01),提示柴苓归芪汤和洛汀新均可抑制FN的过度表达;两治疗组之间无明显差异(P>0.05)。 正常组肾小球中LN表达明显,主要分布于基底膜、系膜区和包曼氏囊,在肾小管基底膜有少量表达,间质中无明显表达。与正常组相比,模型组在肾小球及小管中分布的范围和强度明显扩大和增强,肾间质中有少量表达;两治疗组的表达较模型组明显降低。半定量分析结果显示:模型组LN的相对含量及积分光密度明显高于正常组(P<0.01);两治疗组与模型组相比,其表达显著下降(P<0.01),提示柴苓归芪汤和洛汀新均可抑制LN的过度表达;两治疗组之间无明显差异(P>0.05)。 结论: 1.柴苓归芪汤能抑制阿霉素肾病大鼠肾组织FN、LN的表达。 2.柴苓归芪汤能纠正细胞外基质合成及降解失衡,减轻其在肾小球及小管间质中的过度沉积,延缓肾脏疾病的发展。 第四部分 柴苓归芪汤的抗氧化作用及其对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的影响 目的: 观察柴苓归芪汤的抗氧化作用及其对阿霉素肾病大鼠血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的影响 方法: 模型复制、分组和给药同第一部分。取适量冻存肾组织,在0℃用生理盐水漂洗,滤纸拭干,称重。用生理盐水做匀浆缓冲液,制成10%组织匀浆。离心取上清液,用SOD、MDA试剂盒测定肾组织SOD、MDA。测定AngⅡ的匀浆制备步骤同SOD、MDA。用AngⅡ放免分析试剂盒以放免法测定AngⅡ浓度。测定结果用上清液中蛋白质含量进行校正。蛋白质测定按福林-酚法(Lowry氏法)进行。 结果: 模型组大鼠肾组织SOD含量明显低于正常组(P<0.01),提示阿霉素肾病大鼠抗氧化功能受损;两治疗组与模型组相比,SOD含量明显上升(P<0.05),表明洛汀新和柴苓归芪汤均有抗氧化损伤作用。两治疗组之间无明显差异(P>0.05)。模型组大鼠肾组织MDA含量明显高于正常组(P<0.05),提示阿霉素肾病大鼠存在氧化损伤;两治疗组与模型组相比,肾组织MDA含量降低(P<0.01;P<0.05),提示柴苓归芪汤和洛汀新有修复氧化损伤作用。 结论: 1.柴苓归芪汤可以提高阿霉素肾病大鼠肾组织SOD含量,降低肾组织MDA含量,提示该方具有清除氧自由基,抗组织脂质过氧化损伤的作用。 2.柴苓归芪汤能抑制阿霉素肾病大鼠肾组织局部AngⅡ的过度表达,减轻由此引起的肾组织损伤,延缓肾脏疾病的进展。 综合上述四个部分的结果进行分析可得到如下结论: 1.柴苓归芪汤能降低尿蛋白、提高血浆蛋白、改善脂质代谢紊乱、减轻肾小球和肾小管的病理损害、保护肾功能,是治疗肾病综合征,延缓其进程的有效方剂。 2.柴苓归芪汤延缓阿霉素肾病进展的作用机制:(1)抑制阿霉素肾病大鼠肾组织FN、LN的表达,纠正细外基质合成及降解失衡,减轻其在肾小球及小管间质中的过度沉积。(2)抑制阿霉素肾病大鼠肾组织局部AngⅡ的表达,减轻由此引起的各种病理损伤,延缓肾脏疾病的发展。(3)柴苓归芪汤能提高阿霉素肾病大鼠肾组织SOD含量,降低肾组织MDA含量,提高组织抗氧化能力,从而减轻组织脂质过氧化损伤。