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目的了解近十年我国艾滋病三间分布特征及流行趋势,为艾滋病防治提供线索。探讨补体在艾滋病发病中的作用及其机制,通过靶向补体激活蛋白CR2-IgG1F(c以下简写CR2-Fc)抑制HIV感染的实验研究,为艾滋病防控提供新思路。方法1.描述性分析(1)数据来源与数据整理2004-2013年度我国31个省(直辖市、自治区)艾滋病发病及死亡疫情数据(不含港、澳、台)来源于中国疾病监测信息报告管理系统;各省份人口数据来源于国家人口与健康科学数据共享平台;1:400万的全国省(直辖市、自治区)级电子地图来源于国家地理信息研究所。将所得数据分类、筛选后导入Excel2010。(2)研究方法采用描述性流行病学分析方法对2004-2013年我国艾滋病流行现状进行分析,重点描述艾滋病的三间分布特征及流行趋势。(3)统计分析方法将导入Excel2010的数据建立数据库,用SAS9.2统计软件对发病率、死亡率和构成比等研究指标进行统计分析,率和构成比的比较用χ2检验。利用Excel2010、GraphPad Prism5.0软件进行图表处理。2.靶向补体激活蛋白CR2-Fc的表达、活性检测及抑制HIV感染体外实验(1)补体激活蛋白CR2-Fc的表达与纯化将PCR扩增得到的人CR2(SCR1-4)基因和人IgG1Fc基因进行连接并构建入T载体。XbaⅠ和NotⅠ双酶切测序正确的重组T载体和pCI-neo真核表达载体,应用T4连接酶将CR2-Fc基因连接到真核表达载体中,得到重组真核表达载体pCI-neo/CR2-Fc。重组真核表达载体转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),G418筛选获得稳定表达细胞株。RT-PCR、Western blot检测目的蛋白CR2-Fc的表达。稳定表达目的蛋白的单克隆细胞株进行无血清培养,培养上清应用proteinG琼脂糖亲和纯化柱进行目的蛋白的亲和纯化。应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gelelectrophoresis,PAGE)和BCA蛋白定量法对纯化后的CR2-Fc蛋白进行检测。(2)CR2-Fc蛋白生物活性鉴定与抑制HIV感染体外实验绵羊红细胞溶解实验判断CR2-Fc激活补体的能力,即在补体致敏的反应体系中加入梯度稀释的CR2-Fc蛋白,判断CR2-Fc的含量与补体活化程度之间的剂量-效应关系。应用Anti-CR2mAb(clone1048)封闭CR2-Fc的C3d结合位点,观察溶血变化;流式细胞术检测CR2-Fc与细胞表面的C3d结合靶向性,使用APC标记的Anti-C3d mAb和FITC标记的Anti-CR2mAb两种抗体检测细胞表面的双荧光信号;PBS替代CR2-Fc或EDTA阻断C3d沉积,观察细胞表面荧光变化。游离HIV杀伤实验,即在含等量HIV-1体系中加入梯度稀释的CR2-Fc分子活化补体,48h后分别感染相同数量Tzm-BL细胞。HIV感染Tzm-BL细胞后即激活荧光基团,通过检测细胞荧光强度可以推断HIV数量,间接判断HIV杀伤率;ATP荧光法评估CR2-Fc对感染HIV细胞的影响,即通过ATP产生的荧光信号估计活细胞数,以此判断CR2-Fc溶解细胞的能力。在HIV-1感染的H9细胞中加入不同浓度的CR2-Fc以及等量的正常人血清共同孵育,检测细胞的ATP荧光值。结果1.2004-2013年我国艾滋病流行现状的描述性流行病学分析(1)2004-2013年,我国艾滋病年均发病率为1.67/10万,年均死亡率为0.48/10万。近10年来,我国艾滋病发病率、死亡率均呈逐年上升趋势(发病率变化趋势卡方检测Z=295.27,p<0.05;死亡率变化趋势卡方检验Z=154.06,p<0.05)。发病率由2004年的0.28/10万升至2013年的3.06/10万,增幅达992.86%;死亡率由2004年的0.06/10万升至2013年的0.83/10万,增幅为1283.33%。(2)2004-2013年,全国31个省(直辖市、自治区)均有艾滋病病例报告,发病率高于1/10万的省份由2004年的1个上升到了2013年的21个。我国艾滋病疫情呈现流行范围广和地区差异大的特点。艾滋病高发区主要集中在我国西南部,广西省艾滋病年均发病率为6.51/10万居全国首位,其它发病率较高的省份依次是云南、新疆、河南,发病率分别为5.29/10万、3.89/10万、2.10/10万。年均发病率较低的3个省份依次为:山东省0.12/10万,内蒙古0.13/10万和西藏0.16/10万。(3)2004-2013年我国艾滋病发病人群男性明显多于女性,男性病例占到总病例数的70.48%,男女病例性别比为3.88:1。近10年男女病例性别比呈逐年增高趋势(趋势卡方检验Z=32.17,p<0.05),比值由2004年的1.92:1上升至2013年的2.97:1。从年龄分布来看,艾滋病发病以青壮年为主,20-59岁病例占到总病例的86.35%。其中30-39岁年龄组为艾滋病高发年龄组,病例数占总报告病例的32.38%,其次是40-49岁年龄组的21.67%和20-29岁年龄组的20.57%。0-9岁年龄组病例最少,仅占全部病例的1.12%。2.靶向补体激活蛋白CR2-Fc的表达、活性鉴定及抑制HIV感染体外实验(1)重组真核表达载体的构建、CR2-Fc蛋白的表达与纯化利用PCR成功合成了人CR2(SCR1-4)基因和人IgG1Fc基因,1%琼脂糖凝胶电泳可见CR2-Fc基因条带位于1,800bp处;双酶切重组真核表达载体,电泳可见5,800bp和1,800bp两条条带,与预期结果一致;CR2-Fc基因的测序结果与GenBank中序列一致,证实目的基因准确无误。RT-PCR检测细胞内mRNA:1%琼脂糖凝胶电泳显示目的条带约1800bp,与预期一致,证明细胞内存在CR2-Fc的转录。使用Anti-CR2mAb(clone1048)以及Anti-IgG1Fc mAb分别作为检测抗体对细胞转染上清进行Western blot检测,结果显示:还原态样本位于60kDa处,与预期结果一致;非还原态样本位于130kDa处,提示自然条件下CR2-Fc以二聚体的形式存在。空载体转染上清作对照未见条带;纯化样本进行SDS-PAGE检测,结果显示:还原态样本位于60kDa处,非还原态样本约为130kDa,结果与Western blot结果一致。Quantity One软件分析SDS-PAGE结果,样本蛋白纯度大于90%。BCA法蛋白定量得到CR2-Fc蛋白浓度约为900μg/ml。(2)CR2-Fc生物活性鉴定及抑制HIV感染体外实验蛋白活性鉴定:溶血实验结果,显示随着CR2-Fc浓度增加,红细胞溶解率显著提高(趋势卡方检验Z=2.12,p<0.05)。添加过量的Anti-CR2mAb(clone1048,250μg/ml),溶血率未发生明显变化,表明Anti-CR2mAb能竞争性抑制CR2-Fc与C3d的结合作用;流式细胞术检测结果显示:正常激活补体并加入CR2-Fc分子,能够在细胞表面检测到APC及FITC双荧光信号;正常激活补体并用PBS取代CR2-Fc分子,只能在细胞表面检测到APC荧光信号;42mM EDTA阻断补体激活,则无APC和FITC荧光信号检出。抑制HIV感染体外实验:利用Tzm-BL细胞荧光法检测CR2-Fc对游离HIV杀伤能力,结果发现,当低浓度中和抗体存在时,融合蛋白CR2-Fc能够靶向结合于HIV-1表面的C3d分子,通过级联放大激活补体,提高补体溶解HIV的作用。随着CR2-Fc分子浓度增加,HIV-1杀伤率增加,当CR2-Fc浓度为10.31μM达到峰值,HIV-1的杀伤率为34.26±6.43%。用C6缺陷血清取代NHS后,荧光信号未见明显变化;ATP荧光法结果提示,补体对H9细胞表面HIV杀伤能够引起细胞溶解。随着CR2-Fc浓度增加,溶解受感染细胞能力增强,细胞溶解率由-2.10±3.52%(CR2-Fc浓度0.01μM)上升至18.49±4.28%(CR2-Fc浓度10.31μM)。用C6缺陷血清替代正常人血清,荧光检测结果未见明显变化。结论近十年我国艾滋病疫情发病率及死亡率呈现逐年升高趋势,艾滋病发病具有疫情分布广、地区差异大的特点,因此目前我国艾滋病疫情依然严峻,防控形势不容乐观;为进一步提高艾滋病的防治能力,本研究针对补体在艾滋病感染机制中的作用和特点,构建并表达了一种新型靶向局部补体激活蛋白CR2-Fc。实验证实,CR2-Fc具有很好的生物学活性及抑制HIV-1感染能力。