前言:雄激素性脱发(Androgenetic Alopecia,AGA)主要发生于20-55岁左右男性,表现为从前额两侧开始头发密度下降,头发纤细、稀疏,逐渐向头顶延伸,额部发迹向后退缩,前额变高,形成“高额”,前发际线呈M形,或从头顶部毛发开始脱落。脱发区皮肤光滑,可见纤细的毳毛,可伴有头皮油脂分泌增加。女性雄激素性脱发一般不累及颞额部且病情一般较轻、脱发进程缓慢。AGA虽不影响身体健康,但却因破坏了患者的自身形象而引起广泛关注。有多种方法可用于AGA的治疗,包括口服非那雄胺、外用米诺地尔、光电治疗、植发治疗等,但没有一种单一的方法是十分有效的,目前很多学者也在尝试研究改善AGA的治疗效果,其中微针联合导入米诺地尔在治疗脱发领域的价值一直很受期待,但相关的研究尚少。AGA的发病机制为血液循环中雄激素、II型5α还原酶水平升高及局部雄激素受体高表达,从而导致头顶部毛囊逐渐萎缩,毛囊体积缩小,终毛毛囊逐渐转变为毳毛毛囊,最后毛囊消失。与AGA发病关系最密切的信号转导通路为Wnt/β-Catenin通路,该通路在诱导毛囊生成、促进毛囊生长中扮演着重要的角色。JAK-STAT是近年来新发现的一条与毛发生长密切相关的通路,有学者进行实验发现,局部应用小分子JAK-STAT信号通路抑制剂可使毛囊迅速进入生长期并且促进毛发生长,但相关研究尚少。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)是一类长度超过200nt的非编码RNA,其本身并不编码蛋白,故一直被认为是基因转录的“噪音”而未受重视,然而,最近有研究表明,LncRNA蕴含的信息十分丰富,与人类疾病的发生、发展和防治都有着密切联系。在与AGA相关的实验中,还未涉及到有关LncRNA的研究,故探究LncRNA与AGA之间的关系具有重大意义。目前有关AGA的研究中,大部分为临床效果评价,仅有一定程度的定性说明,而机制研究也多集中在动物实验研究,缺乏深入的针对人体组织的定量及分子机制研究。因此,我们设计了本试验,来观察微针技术结合5%米诺地尔外用治疗男性AGA,通过主客观评价和组织病理研究来观察其疗效及安全性,而后利用基因芯片和PCR Array技术筛选出与男性AGA密切相关的LncRNA、m RNA及相关信号通路中(Wnt/β-Catenin及JAK-STAT通路)表达有差异的基因,以期望能找到可能的AGA发病机制。之后检测治疗前后各组头皮组织在相关信号转导通路中差异表达最明显的分子的mRNA及蛋白水平的变化,为临床有效性提供理论依据。材料与方法:一、研究对象招募60名20-60岁(平均37.4±1.5岁),病史1-30年(平均8.1±0.5年),脱发类型为Norwood-Hamilton III-VI型男性雄激素性脱发志愿者。排除标准:有明确系统性疾病者,头皮有感染、破溃或合并其他皮肤疾病者,4周内系统应用过糖皮质激素或免疫抑制剂者,半年内接受过AGA治疗的患者,依从性差者。入组前均告知其风险、利益、术后可能并发症,并签署知情同意书及照片使用协议。二、治疗前准备及治疗过程(一)治疗前准备建立个人档案,指定照相室照相,留取受试者头部照片,使用毛发检测仪系统对头部脱发固定部位进行毛发密度和直径检测,在治疗部位敷麻药1小时,后生理盐水清洁,75%酒精消毒。(二)治疗过程按照随机分配原则将志愿者随机分为3组,每组20人。第一组为单独外用5%米诺地尔治疗组,第二组为单独使用微针治疗组,第三组为同时使用微针联合外用5%米诺地尔治疗组。微针治疗间隔为3周,共治疗8次,即治疗时间为6个月。微针治疗深度为1-2mm,每次2-3遍。第三组微针治疗的同时导入2ml米诺地尔酊。应用5%米诺地尔酊的治疗组,志愿者每天外用两次,每次约1ml,从治疗第1天起,连续使用6个月。单独外用米诺地尔治疗的志愿者,每3周回访一次。每次回访,详细记录各组志愿者不良反应。每个治疗组各有5~6名受试者自愿进行脱发部位治疗前后头皮病理取材,治疗后病理取材时间为末次治疗后3周。此研究相关伦理批件号为:科伦审[2017]136号。三、疗效评价医生及受试者主观评价;疗效客观评价包括治疗前后及回访时使用数码相机拍照及毛发检测仪系统进行头发密度和直径的评估;不良反应评估及预后;组织学检查为治疗前后头皮组织制作石蜡切片,后行HE染色,并在光学显微镜下观察,以比较各治疗组治疗前后毛囊数量及形态的变化。四、男性雄激素性脱发相关长链非编码RNA及其共表达mRNA的初步筛选与通路分析对比男性雄激素性脱发志愿者头顶部脱发及非脱发部位LncRNA及mRNA的表达,并进行男性雄激素性脱发相关通路预测分析(从中选择2条信号转导通路行后续实验),最后用荧光实时定量PCR技术进一步验证芯片检测结果。志愿者为10名30-60岁男性雄激素性脱发患者,脱发类型为Norwood-Hamilton V-VI型,取其中三对脱发及非脱发部位标本进行基因芯片检测,其余七对标本用作后续验证。五、雄激素性脱发治疗前脱发、非脱发及脱发治疗后部位头皮组织在Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路中的表达差异对比微针结合米诺地尔治疗组男性雄激素性脱发志愿者治疗前头顶部脱发、非脱发部位及脱发治疗后部位Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路的分子表达,并用荧光实时定量PCR进一步验证PCR Array实验结果。志愿者为6名30-60岁男性雄激素性脱发患者,脱发类型为Norwood-Hamilton V-VI型,治疗后组织留取部位为头顶部脱发治疗后部位。取其中三对治疗前脱发、非脱发部位及脱发治疗后部位标本进行基因通路检测,其余三对取治疗前脱发及非脱发部位标本用作后续验证。六、雄激素性脱发治疗前后各组头皮中Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路差异表达分子的变化应用荧光实时定量PCR、免疫组化及Western blot技术进一步检测各治疗组治疗前后于Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路中差异表达的分子(FZD3、CXCL9及IL2RA)和与雄激素性脱发发病密切相关的分子(β-Catenin、LEF-1及TGF-β1)的表达变化。七、统计学分析采用SPSS 18.0进行数据统计分析处理,P<0.05为有统计学差异。结果:一、临床观察结果微针联合米诺地尔外用治疗组疗效最佳,医生主观评价中,35%的志愿者脱发情况有明显改善,60%的志愿者有中度改善,志愿者主观评价中,80%的志愿者脱发有50%以上改善。治疗后与治疗前相比,终毛密度增加了55.7±31.1根/cm~2,治疗后终毛平均直径较治疗前增加21.1±15.3μm。从临床表现来看,治疗后志愿者头顶部脱发情况有明显改善,毛发密度显著增大。组织病理可见,治疗前各组生长期毛发较少,而治疗后各组毛囊数量增多,且生长期毛发显著增加。疗程结束后6个月志愿者回访,可见再生毛发维持较好,仅有少量毛发脱落。三组间不良反应发生情况未见明显差异,志愿者出现副作用无需治疗,3-4天后可自行缓解。应用微针治疗组,头皮感染及淋巴结肿大发生率较高。二、男性雄激素性脱发相关长链非编码RNA及其共表达mRNA的初步筛选与通路分析结果(一)LncRNA及其共表达mRNA表达谱特异表达的筛选结果基因芯片共检测了40173个LncRNA及20730个mRNA,其中表达有差异的LncRNA有2143个,mRNA有2821个。与正常头皮组织相比,脱发部位组织表达上调的LncRNA有770个,表达下调的有1373个,表达上调的mRNA有2141个,表达下调的有680个(表达差异倍数>2.4)。(二)LncRNA共表达mRNA的相关通路分析采用KEGG pathway富集分析对LncRNA共表达的mRNA进行相关通路预测,结果显示,与正常头皮组织相比,脱发部位组织有53个通路与上调的共表达mRNA有关,11个通路与下调的共表达mRNA有关。于上调信号通路中选择JAK-STAT通路,下调信号通路中选择Wnt/β-Catenin通路进行后续研究。(三)特异表达的LncRNA及其共表达mRNA的验证采用实时荧光定量PCR法进一步验证表达有差异的LncRNA和共表达mRNA的表达水平。我们从芯片结果中筛选出特异表达的5个LncRNA(G001747、G012997、RP11-818024.3、RP11-76908.2、G036413)和5个共表达的mRNA(PRAC2、KRTAP20-1、ARL6IP1、SPDYE4、STARD9),结果显示,与脱发部位头皮组织相比,相邻非脱发正常组织5种LncRNAs中G001747、G012997表达上调,而RP11-818024.3、RP11-76908.2、G036413表达下调,5种mRNAs中PRAC2、KRTAP20-1、ARL6IP1表达上调,而SPDYE4、STARD9表达下调。实时荧光定量PCR结果与芯片结果一致。三、雄激素性脱发治疗前脱发、非脱发及脱发治疗后部位头皮组织在Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路中的表达差异(一)治疗前脱发、非脱发及脱发治疗后部位头皮组织在Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号通路中相关基因的表达结果PCR Array结果显示,与脱发部位相比,非脱发部位Wnt/β-Catenin通路有16个基因表达上调,2个基因表达下调,JAK-STAT通路有10个基因表达下调,无基因表达上调。与脱发部位相比,脱发治疗后部位Wnt/β-Catenin通路有8个基因表达上调,有3个基因表达下调,JAK-STAT通路有17个基因表达上调,2个基因表达下调。非脱发部位、脱发治疗后部位与脱发部位相比,Wnt/β-Catenin通路无共同表达下调的基因,而共同表达上调的基因有4个,其中FZD3表达差异最大,JAK-STAT通路无共同表达上调及下调的基因,但有6个治疗前非脱发与脱发部位相比表达显著下调的基因在脱发治疗后表达明显增高,其中CXCL9、IL2RA表达差异最大。(二)雄激素性脱发与非脱发正常头皮组织中FZD3,CXCL9,IL2RA的差异性表达进一步应用荧光实时定量PCR技术检测脱发及非脱发头皮组织FZD3、CXCL9及IL2RA的表达结果显示:FZD3于非脱发头皮组织表达较脱发头皮组织高,而CXCL9、IL2RA于脱发头皮组织表达较非脱发头皮组织高,表达差异均有显著统计学意义。四、雄激素性脱发治疗前后各组头皮中Wnt/β-Catenin及JAK-STAT信号转导通路差异表达分子的变化(一)雄激素性脱发治疗后各组FZD3、CXCL9、IL2RA、β-Catenin、LEF-1及TGF-β1的mRNA水平变化单独应用米诺地尔治疗组,FZD3及β-Catenin治疗后较治疗前增高,且有统计学意义;单独应用微针治疗组CXCL9及IL2RA表达治疗后较治疗前增高,且有统计学意义,其余基因表达无差异;联合应用微针及米诺地尔治疗组,FZD3、β-Catenin及LEF-1表达治疗后较治疗前有显著增高,TGF-β1治疗后较治疗前表达有显著下降,且较单独应用微针及单独应用米诺地尔治疗表达差异更加显著,CXCL9及IL2RA治疗前后表达虽无差异,但治疗后较治疗前表达下降。(二)雄激素性脱发治疗后各组FZD3、CXCL9、IL2RA、β-Catenin及LEF-1的蛋白水平变化免疫组化结果显示,单独应用米诺地尔治疗组FZD3、LEF-1、CXCL9及IL2RA治疗后均表达下降,但治疗前后表达变化无意义;单独应用微针治疗组各指标治疗后均表达升高,但各指标治疗前后表达变化无意义;联合应用米诺地尔及微针治疗组,FZD3、LEF-1治疗后表达升高,CXCL9、IL2RA治疗后表达下降,除IL2RA外,其余各指标治疗前后表达变化有统计学意义。Western blot结果显示,治疗后与治疗前相比,单独应用微针及联合治疗组FZD3、β-Catenin及LEF-1蛋白表达增加,单独应用米诺地尔组各指标表达下降,β-Catenin及LEF-1蛋白表达各组间差异显著,联合治疗组治疗前后FZD3表达差异显著。结论:1、微针联合5%米诺地尔酊外用能有效治疗男性雄激素性脱发,联合治疗方法比单独应用微针及单独外用米诺地尔治疗效果更佳。2、雄激素性脱发部位头皮组织与正常头皮组织相比,Lnc RNA及其共表达mRNA的表达具有明显差异,差异基因与雄脱之间的联系仍需深入研究,其可能作为新的生物学标志物在诊断与判断雄脱疗效中发挥巨大作用。3、Wnt/β-Catenin通路表达上调、JAK-STAT通路表达下调可抑制脱发发生。FZD3高表达可促进毛发生长,其机制可能为Wnt5a蛋白与FZD3蛋白结合后增加了LEF-1表达,从而激活相关靶基因的转录。雄激素性脱发的发病与CXCL9及IL2RA有相关性,说明雄激素性脱发的发生与自身免疫反应及免疫调节失衡有密切联系。4、微针联合5%米诺地尔外用治疗可使雄激素性脱发头皮组织中FZD3的mRNA及蛋白表达增加、IL2RA及CXCL9的mRNA及蛋白表达下降,推测微针联合米诺地尔外用可通过激活Wnt信号通路、抑制JAK-STAT通路来治疗雄激素性脱发。