背景和目的急性冠状动脉事件(不稳定型心绞痛、急性心肌梗塞)是危害人类健康的常见和严重的疾病。急性冠状动脉事件是由冠状动脉的粥样硬化斑块破裂、继发性血栓形成导致血管闭塞和心肌缺血而引起。在动脉粥样硬化性疾病中,多种因素参与了其病变的发生及发展过程,其中血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)功能异常在内膜增生、斑块形成及血管狭窄中发挥了重要作用,是该类病理过程的重要始动因素。VSMCs是血管壁细胞的主要成分,VSMCs并不是一种处在终端分化状态的细胞,其在增殖、迁移、转化等方面具有较高的可塑性。当发生血管损伤时,VSMCs从收缩型转变为合成型以促进血管修复。而一旦损伤引起的病变得到修复,健康血管的VSMCs迅速转变回非增殖的收缩表型。然而,在病理情况下,血管平滑肌细胞的表型发生失调,这将导致心血管疾病的发生及发展。异常的VSMCs表型在动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等疾病的发生发展中发挥着重要的作用。新近,有学者在动脉血管壁分离获得一类新型干细胞,其表达Sox17、Sox10及S100β等多潜能标志物,可以分化为平滑肌细胞;该研究发现,在血管损伤后,部分合成型VSMCs并非来源于收缩型VSMCs的转化,而是来源于多潜能的血管干细胞,提示血管壁衍生的多潜能干细胞分化为合成型VSMCs,这是动脉粥样硬化疾病发生发展的重要机制。而VSMCs增殖、迁移、转化等过程背后的调控机制更是值得进一步的深入探讨。大量研究表明,心血管系统疾病的病理生理过程常常伴随着诸多基因表达谱的变化。随着基础研究的深入,环状RNA(circRNA)作为一类特殊的非编码RNA越来越引起重视,其具有稳定的闭环结构,在人体细胞广泛表达,具有充当微小RNA(miRNA)的分子海绵的作用,调控亲本基因转录、表达等。近年来,circRNA在心血管疾病中发挥的重要调控作用也逐渐被认识并被认可。然而,血管平滑肌细胞中circRNA的表达谱及其对血管平滑肌细胞增殖和迁移等的调控机制仍不清楚。本研究通过对circRNA进行微阵列分析,从而探究在体外高浓度葡萄糖诱导的平滑肌细胞中circRNA的表达谱。在体外试验中,我们筛选出存在差异表达的环状RNA WDR77(circRNA WDR77),应用生物信息学方法探寻circRNA WDR77调控的下游靶点,并利用功能验证实验进一步明确相关circRNA及其下游靶点信号通路对VSMCs的增殖和迁移的作用和机制,为阐明circRNA在心血管相关的病变中的角色及其治疗靶点提供新的可能的理论依据和实验依据。材料和方法1.通过对circRNA的微阵列分析,研究体外高浓度葡萄糖培养诱导的血管平滑肌细胞中circRNA的表达谱与在正常葡萄糖浓度下培养的对照细胞的不同。从表达存在差异的circRNA中,我们进一步筛选了存在较大差异表达的circRNA WDR77,并进行了进一步的分子机制研究。2.体外培养人血管平滑肌细胞,应用siRNA对circRNA WDR77基因进行敲低实验,并通过MTT检测血管平滑肌细胞的存活细胞数;通过应用流式细胞仪对细胞周期进行分析检测;通过Transwell迁移实验和划痕试验探究了 circRNA WDR77敲低对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。3.使用标准富集计算方法进行基因本体分析,对基因进行分类。基于京都基因和基因组百科全书,筛选所涉及的生物信号传导通路。预测分析circRNA WDR77的下游靶点,并通过荧光素酶测定、RNA免疫沉淀技术验证其与信号通路中信号分子的结合作用。4.通过荧光素酶测定、RNA免疫沉淀技术探究circRNA WDR77对其下游靶点miR-124的表达的影响。5.应用 Western blot法、RT-PCR进一步验证和明确 circRNA WDR77对 miR-124/FGF2信号通路的调控作用及可能的机制。结果1.我们采取了高浓度葡萄糖(27.5mmol/L)培养条件,以模拟体外糖尿病状态,同时,采用正常葡萄糖浓度(5.5mmol/L)培养条件进行对照研究。发现与正常浓度葡萄糖组相比,高浓度葡萄糖干预组中circRNA的表达谱中共有983个存在差异表达,包括458个上调和525个下调。在这些存在差异表达的circRNA中,有31个上调的和22个下调的circRNA发生了 2倍及以上的变化(P<0.05)。2.在用高浓度葡萄糖处理的血管平滑肌细胞中,circRNAWDR77表达与正常浓度葡萄糖培养条件组比较,呈现出显著的上调表达趋势。3.在高浓度葡萄糖干预的血管平滑肌细胞培养组中,转染si-circWDR77后其circRNA WDR77的表达明显降低;通过MTT检测结果显示,与对照组相比,circRNA WDR77敲低,降低了血管平滑肌细胞的存活细胞数。而通过流式细胞仪进行细胞周期分析检测表明,circRNA WDR77敲低可以诱导血管平滑肌细胞G0/G1期的阻滞,从而抑制细胞周期的进展并抑制细胞增殖。Transwell迁移实验和划痕试验表明,与对照组相比,circRNA WDR77敲低会导致细胞迁移数量和迁移距离的减少。总之,circRNA WDR77敲低可以抑制高浓度葡萄糖干预的血管平滑肌细胞的增殖和迁移。4.荧光素酶法测定、RNA免疫沉淀法及RT-PCR法检测结果显示,与对照组相比,miR-124的表达在高浓度葡萄糖诱导的血管平滑肌细胞中显著下调。5.通过对FGF2的mRNA和蛋白的表达进行检测,发现circRNA WDR77敲低可以使FGF2表达下降,而这种作用可以由miR-124抑制剂逆转。MTT结果显示miR-124抑制剂也可逆转circRNA WDR77敲低对细胞增殖的抑制作用。细胞周期分析表明miR-124抑制剂能够恢复因circRNA WDR77敲低所诱导发生的G0/G1期阻滞现象。而Transwell迁移实验和细胞划痕实验表明miR-124抑制剂可以恢复因circRNA WDR77敲低所引起的迁移距离减少。结论1.与正常浓度的葡萄糖培养相比,高浓度的葡萄糖培养会引起血管平滑肌细胞中circRNA的表达谱发生显著的差异性表达。2.与正常浓度葡萄糖组比较,在高浓度葡萄糖培养干预的血管平滑肌细胞中,circRNA WDR77表达呈现显著上调的趋势。3.circRNA WDR77敲低可以抑制在高浓度葡萄糖中培养的血管平滑肌细胞的存活、增殖和迁移。4.circRNA WDR77靶向作用于miR-124,并呈现负相关作用。5.circRNA WDR77通过miR-124的介导对FGF2发挥作用,从而调控血管平滑肌细胞的存活、增殖和迁移。6.上述通路是circRNA WDR77在血管平滑肌细胞的增殖和迁移中发挥作用的途径。